Abstract
Eksistensen af stamceller i humant fostervand blev rapporteret for første gang for næsten ti år siden. Siden denne opdagelse er viden om disse celler steget dramatisk siden denne opdagelse. I dag er fostervandsstamceller (AFS-celler) bredt accepteret som et nyt kraftfuldt redskab til grundforskning såvel som til etablering af nye stamcellebaserede terapikoncepter. Det er muligt at generere monoklonale genomisk stabile AFS-cellelinjer med et højt proliferativt potentiale uden at rejse etiske spørgsmål. Mange forskellige grupper har vist, at AFS-celler kan differentieres til alle tre kimlagslinjer, hvilket er af relevans for både den videnskabelige og terapeutiske anvendelse af disse celler. Af særlig betydning for sidstnævnte er det faktum, at AFS-celler er mindre tumorigene end andre pluripotente stamcelletyper. I denne artikel har vi opsummeret den aktuelle viden om dette relativt unge videnskabelige område. Desuden diskuterer vi de relevante fremtidsperspektiver for dette lovende område inden for stamcelleforskning med fokus på de næste vigtige spørgsmål, som skal besvares.
1. Indledning
Selv om humane fostervandsceller anvendes i vid udstrækning i rutinemæssig prænatal diagnose, er kendskabet til disse celler fortsat begrænset. Men forestillingen om, at der findes udifferentierede og differentierede celler af forskellig oprindelse og afstamning i fostervand, er blevet støttet af flere rapporter i løbet af de sidste tre årtier. Dette er ikke overraskende, når man tager i betragtning, at der i fostervand er påvist celler fra fosterhinden, fosterhuden og fosterets urogenitale, respiratoriske og gastrointestinale system i fostervand. Under langvarig svangerskab kan føtale respiratoriske, urin- og tarmsekretioner findes i fostervæsken. Desuden er det også kendt, at sammensætningen, morfologien og vækstegenskaberne af fostervandscelleprøver påvirkes af visse fosterpatologier, som f.eks. neuralrørsdefekter eller gastroschisis.
Ny interesse for celler fra fostervand blev indledt af to uafhængige resultater. I 2001 blev det foreslået, at fostervandsceller kunne anvendes i vævsteknologiske metoder til kirurgisk reparation af medfødte anomalier i den perinatale periode. Forfatterne isolerede mekanisk en subpopulation af celler fra fostervand fra drægtige moderfår med en særlig morfologi. Den immuncytokemiske profil af disse celler var meget sammenlignelig med celler af mesenkymal, fibroblast/myofibroblast-linjeage. Disse celler, der stammer fra fostervæske, udviser en betydeligt hurtigere proliferation end sammenlignelige føtale og voksne celler og kunne dyrkes på polyglycolsyrepolymer-stilladser op til konfluente cellelag . Det er oprindeligt blevet diskuteret, at en sådan konstrueret konstruktion ville være optimal til at fungere som et transplantat til implantation enten i den neonatale periode eller endda før fødslen. Dette kunne være af særlig interesse for børn, der er født med en defekt i kropsvæggen, og som er for unge til, at der kan tages et transplantat fra et andet sted i deres krop med henblik på rekonstruktiv kirurgi . De resultater, der er opnået i dyremodeller, er virkelig opmuntrende. Men så vidt vi ved, er vi ikke bekendt med en rapport, der beskriver den kliniske anvendelse af en sådan cellebaseret terapitilgang hos mennesker indtil nu.
Et andet fund om fostervandsceller har sat gang i et meget lovende og hurtigt voksende forskningsområde. For næsten ti år siden blev den første antydning af humant fostervand som en ny formodet kilde til stamceller offentliggjort . Det første bevis for eksistensen af AFS-celler blev påvist ved opdagelsen af en stærkt proliferativ celletype i humant fostervand, der udtrykker den pluripotente stamcellemarkør Oct4. Ud over at disse celler udtrykker markører, der er kendt for at være specifikke for pluripotente stamceller, blev det påvist, at de udtrykker cellecyklusproteiner, der er kendt for at være specifikke for cyklende celler . Efter denne første beskrivelse har mange grupper bekræftet eksistensen af disse Oct4+/c-Kit+ AFS-celler og har rapporteret om deres potentiale til at differentiere til hæmatopoietiske, neurogene, osteogene, chondrogene, adipogene, renale, hepatiske og forskellige andre lineager . Selv om AFS-cellerne med hensyn til deres biologiske egenskaber og markørudtrykkelsesmønster synes at ligne embryonale stamceller (ES) mere end f.eks. trophoblastceller, er AFS-cellernes præcise oprindelse stadig uklar. Biokemiske, immuncytokemiske, biologiske og morfologiske undersøgelser viste, at AFS-celler udgør en ny og specifik enhed, der adskiller sig fra ES-celler eller andre stamcelletyper, f.eks. dem, der kan isoleres fra amniotiske epitelceller eller trophoblastiske kilder. I dag er det af stor interesse at afklare to relevante spørgsmål med hensyn til AFS-celler. Hvor kommer de fra? Har de en biologisk funktion in vivo? Vi har allerede tidligere diskuteret, at AFS-celler sandsynligvis kan spille en rolle i intrauterine sårhelingsprocesser. Indtil videre findes der dog ingen eksperimentel støtte for denne hypotese. Det er indlysende, at de eksperimentelle rammer, der gør det muligt at bevise denne hypotese, ikke er særlig lette at forestille sig eller praktiske på nuværende tidspunkt (eller endnu ikke er udviklet).
Siden deres første opdagelse har det været af største betydning at afklare spørgsmålet om, hvorvidt AFS-celler virkelig har pluripotent differentieringspotentiale ved med succes at indlede differentieringen til forskellige lineager med udgangspunkt i en enkelt stamcelle. Det er relevant at bemærke, at mange forskellige rapporter i litteraturen, der hævder at beskrive forskning i AFS-celler, ikke engang har præciseret, hvilken type celler de arbejder med. Ofte har forskerne blot anvendt en blanding af celler fra fostervand, der er fremstillet ved hjælp af specifikke dyrkningsprocedurer. Som nævnt ovenfor indeholder sådanne celleblandinger fra fostervand imidlertid en bred vifte af specifikke udifferentierede og differentierede celletyper. Når en undersøgelse rapporterer et differentieringspotentiale for specifikke cellelinjer, er det af største relevans først at klarlægge, hvilken startcelletype der blev anvendt (ved detaljeret biologisk og immuncytokemisk karakterisering). Desuden kan man kun få bevis for, at AFS-celler virkelig har et pluripotent differentieringspotentiale, hvis man tager udgangspunkt i en enkelt celle, der er karakteriseret som stamcelle. I alle andre tilfælde kunne man antage, at en blanding af fostervandsceller, der er blevet anvendt som udgangsmateriale, med stor sandsynlighed indeholdt en celletype med potentiale til at differentiere til en bestemt slægt og andre celletyper med andre differentieringspotentialer. Eller den anvendte in vitro-differentieringsprotokol, der er anvendt i nogle undersøgelser, inducerede en udvælgelse (via en vækstfordel) til en allerede (inkluderet) differentieret celletype snarere end en ægte differentiering. Enkeltcelletilgange er obligatoriske og praktiske efter eksperimenter med minimal fortynding.
Den første forskergruppe, som virkelig tog højde for dette, rapporterede, at det var muligt at inducere adipogen, osteogen og neurogen differentiering ud fra en enkelt Oct4-positiv AFS-celle . Forfatterne anvendte en to-trins kulturprotokol efterfulgt af en detaljeret immunocytokemisk karakterisering af den opnåede stamcelletype . Tre år senere isolerede en anden forskningsgruppe monoklonale AFS-celler via flowcytometrisk selektion og minimal fortynding, som udtrykte stamcellemarkørerne c-Kit og Oct4 . Forfatterne beskrev den første etablering af monoklonale AFS-cellelinjer med et højt proliferativt potentiale, som kunne dyrkes i mange cyklusperioder med en stabil kromosomal status. Ved hjælp af sådanne AFS-cellelinjer kunne de påvise, at der kunne induceres adipogen, osteogen, myogen, endotelial, neurogen og hepatisk celledifferentiering. Det er vigtigt, at disse forfattere også rapporterede, at AFS-celler i modsætning til ES-celler ikke inducerer tumordannelse hos SCID-mus (severe combined immunodeficient (SCID)) (for en detaljeret diskussion af dette aspekt se nedenfor) .
ES-celler kan, når de dyrkes i fravær af differentieringsfaktorer, spontant danne tredimensionelle flercellede aggregater kaldet embryoid bodies. Tidligere er embryoid bodies i vid udstrækning blevet betragtet som et optimalt udgangspunkt for differentiering af stamceller til forskellige lineager. Derfor anses dannelse af embryokroppe efterfulgt af forskellige differentieringsinducerende metoder for at være en passende måde at bevise en specifik stamcelletyps pluripotente differentieringspotentiale på. Derfor var det af interesse at teste, om AFS-celler, der starter fra en enkelt celle, er i stand til at danne embryonale legemer. Monoklonale humane AFS-celler kan faktisk danne embryonale legemer, når de dyrkes uden antidifferentieringsfaktorer under forhold, hvor de ikke kan sætte sig fast på overfladen af dyrkningsskålene og uden kontakt med feederceller. Dannelsen af sådanne tredimensionelle flercellede aggregater ledsages af et fald i udtrykket af stamcellemarkører og af induktion af differentiering til forskellige lineager . Denne undersøgelse, der påviste potentialet til at danne embryoid bodies, var det ultimative bevis for, at AFS-celler er pluripotente. Desuden giver den nu mulighed for at rekapitulere og undersøge de tredimensionelle strukturer og sammenhænge på vævsniveau i forbindelse med mange differentieringsfænomener under tidlig embryogenese hos pattedyr . Disse resultater vedrørende AFS-cellernes pluripotens blev opnået ved hjælp af monoklonale cellelinjer, der blev genereret ved hjælp af magnetisk cellesortering og minimal fortyndingsmetoder fra humane fostervandsprøver. I dag findes der mange forskellige etablerede monoklonale linjer, som kan ekspanderes som umodne stamceller med høj proliferationshastighed i kultur uden behov for feederceller .
Samlet set er den nuværende videnstand, at AFS-celler har potentiale til at differentiere til celletyper i de tre kimlag (ektoderm, mesoderm og endoderm) og kan danne embryoid bodies, der er kendt som det vigtigste trin i differentieringen af pluripotente stamceller. Sammenlignet med andre typer stamceller, f.eks. voksne stamceller, ES-celler eller inducerede pluripotente stamceller (iPS-celler), har AFS-celler specifikke fordele. Voksne stamceller er ofte vanskelige at udtage prøver af, de har et lavere differentieringspotentiale end AFS-celler og kan ikke dyrkes med høj proliferativ aktivitet. Generering af ES-cellelinjer ved at ødelægge et menneskeligt embryon giver anledning til en række etiske spørgsmål, som diskuteres forskelligt fra land til land. Desuden er ES-celler tumorigene, mens AFS-celler, som allerede nævnt ovenfor, ikke inducerer tumordannelse i svære kombinerede immundeficiente mus. Sammenlignet med iPS-celler er der ikke behov for ektopisk induktion af pluripotens i AFS-celler. AFS-celler er genomisk stabile og har hverken den epigenetiske hukommelse eller somatiske mutationer fra allerede differentierede kildeceller. Desuden er det blevet rapporteret, at iPS-celler akkumulerer karyotypiske abnormiteter og genmutationer under opformering i kultur. For nylig er det blevet rapporteret, at iPS-celler under ektopisk induktion af pluripotens kun ufuldstændigt genskaber deres epigenetiske mønster. Dette vigtige resultat skal tages i betragtning, når man planlægger at anvende disse celler til detaljerede undersøgelser af differentieringsprocesser, og når man overvejer at anvende dem til nye mulige terapeutiske metoder. AFS-celler har allerede stamcelleegenskaber og har ikke brug for ektopisk induktion af pluripotens. Desuden udviser AFS-celler allerede stamcellers epigenetiske mønster. Sammenfattende er det ikke overraskende, at mange forsøg i øjeblikket fokuserer på spørgsmålet om, under hvilke betingelser AFS-celler kan anvendes til stamcellebaserede terapier. Desuden bliver AFS-celler i øjeblikket i stigende grad accepteret som et optimalt redskab til grundforskning.
Selv om ES-celler, iPS-celler og AFS-celler anses for at have et pluripotent differentieringspotentiale, er spørgsmålet om, hvorvidt de udviser det samme kvalitative spektrum af differentieringspotentiale, stadig ubesvaret. Pluripotente stamceller defineres som selvreplikerende celler (cellerne kan i sig selv dele sig), som vides at have kapacitet til at udvikle sig til celler og væv i de primære kimlag, ektoderm, mesoderm og endoderm. Det er blevet påvist, at disse tre stamcelletyper (ES-, iPS- og AFS-celler) har potentiale til at differentiere sig til celler i de tre kimlag. Alle tre kan også danne embryoid bodies. Det skal imidlertid afprøves fra sag til sag, om de virkelig har sammenlignelige potentialer til at differentiere sig til en specifik celletype med alle dens kendte biologiske funktioner. Vi mener faktisk, at det er nødvendigt direkte at undersøge og sammenligne deres differentieringspotentiale og udvælge de mest egnede celletyper til grundforskningsprojekter og til den formodede anvendelse i nye stamcellebaserede terapier. Desuden er der en åbenlys forskel mellem disse tre pluripotente stamcelletyper, som bør undersøges nærmere i fremtiden. Siden den første beskrivelse af deres in vitro-dyrkning har ES-celler været kendt for at være tumorigene. På samme måde inducerer iPS-celler tumordannelse, når de transplanteres subkutant i nøgenmus. Derimod er det blevet rapporteret, at AFS-celler ikke danner tumorer i alvorlige kombinerede immundefekte mus. Da sidstnævnte hidtil kun er blevet undersøgt i et projekt, der analyserer et specifikt sæt dyretransplantationer, er der behov for yderligere undersøgelser for at afklare, om AFS-celler virkelig ikke er tumorigene. Hvis dette er tilfældet, vil det naturligvis være en vigtig fordel i forhold til ES- og iPS-celler, i hvert fald med hensyn til en mulig klinisk anvendelse.
2. AFS-celler til terapi: Fremtidige perspektiver
En stor del af begejstringen omkring humane stamceller hænger sammen med klinikeres og patienters håb om, at disse celler engang kan anvendes til celleterapier for et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker. Her må det klart siges, at arbejdet med AFS-cellebaserede terapier stadig er i sin vorden. Mange spørgsmål er i øjeblikket ved at blive undersøgt, og indtil videre er ingen terapeutisk metode baseret på AFS-celler nået frem til klinisk rutinemæssig anvendelse. En række nye forskningsresultater giver imidlertid stærke beviser for, at AFS-celler faktisk kan være et effektivt redskab inden for regenerativ medicin.
For eksempel er akut og kronisk nyresvigt sygdomme med høj sygelighed og dødelighed. Nyretransplantation er fortsat den mest effektive behandlingsmulighed for størstedelen af patienter med nyresygdom i slutstadiet. Desværre er manglen på kompatible organer en meget begrænsende faktor. Behandlingsstrategier er også baseret på konventionel nyredialyse, men dødeligheden for patienter, der kræver kronisk dialyse, er høj. Derfor kom den formodede anvendelse af stamceller i forbindelse med reparation af nyreskader i fokus. Flere nyligt offentliggjorte undersøgelser af renal differentiering af AFS-celler gør det fristende at spekulere i, at disse stamceller engang kunne betragtes som en ny lovende kilde til cellebaserede terapier til reparation af nyreskader og berettiger yderligere undersøgelser i denne retning . Ved hjælp af et nyrereagregationsassay har vi for nylig offentliggjort, at AFS-celler har potentiale til at differentiere sig til nefrogene lineager, og at denne evne afhænger af signalvejen mammalian target of rapamycin (mTOR) (se også diskussionen nedenfor). Andre har vist, at humane AFS-celler kan integreres i nyrevæv, når de injiceres i isolerede embryonale nyrer fra mus, eller at injektion af AFS-celler i beskadigede nyrer fra mus med rhabdomyolyse-relateret akut tubulær nekrose kan have en beskyttende virkning . Selv om disse og andre data gør det fristende at spekulere i, at AFS-celler kan udgøre et alternativ til behandling af f.eks. akut tubulær nekrose, skal der besvares mange flere spørgsmål, før sådanne cellebaserede terapier kan overvejes til rutinemæssig anvendelse hos mennesker.
Af mange forskellige grunde er det også af stor interesse at etablere nye stamcellebaserede terapier til behandling af hidtil uhelbredelige patologier i centralnervesystemet, såsom Parkinsons sygdom, rygmarvsskade, multipel sklerose eller slagtilfælde. Neurale stamceller, som er blevet undersøgt til dette formål, kan findes i det voksne centralnervesystem og i embryonet under udvikling, men disse væv er ikke let tilgængelige og giver anledning til etiske betænkeligheder. I de seneste år har forskellige grupper rapporteret om det neurogene differentieringspotentiale hos AFS-celler. Inden de næste skridt i retning af klinisk anvendelse af AFS-cellebaserede metoder kan overvejes, skal der imidlertid fremlægges bevis for, at AFS virkelig kan danne modne modne neuroner. Faktisk er der stadig en løbende debat i litteraturen om, hvorvidt AFS-celler virkelig er i stand til at danne funktionelle neuroner. I den nærmeste fremtid vil det være meget vigtigt at finde ud af, hvilke neurogene celletyper der kan udvikles fra AFS-celler. Spørgsmålet om, hvorvidt AFS-celler kan differentiere sig til funktionelle modne neuroner, skal undersøges ved at analysere evnen til at affyre tetrodotoxinfølsomme aktionspotentialer med den karakteristiske form og varighed eller ved at påvise synaptisk kommunikation ved hjælp af elektronmikroskopi.
Her vil det være muligt at diskutere nogle flere eksempler på mulige terapeutiske tilgange ved hjælp af AFS-celler. Nogle gange hævdes det, at mange grundlæggende spørgsmål vedrørende oprindelse, tumorigenicitet, differentieringspotentiale, epigenetisk status eller genomisk stabilitet skal undersøges, før AFS-celler yderligere kan overvejes som et terapeutisk værktøj. Vi mener imidlertid, at alle disse aspekter bør undersøges parallelt. Desuden er det for fremtidige overvejelser virkelig vigtigt at sammenligne alle disse egenskaber ved AFS-celler kvantitativt og kvalitativt med egenskaberne ved andre pluripotente eller voksne stamcelletyper.
3. AFS-celler i grundvidenskaben: Fremtidige perspektiver
Stamceller er meget nyttige redskaber til at studere den molekylære og cellulære regulering af differentieringsprocesser. En metode til at få mere at vide om f.eks. et specifikt gens rolle for en bestemt differentieringsproces er at slå det endogene udtryk af det pågældende gen ned. En sådan fremgangsmåde gør det muligt at klarlægge den rolle, som moduleret genekspression spiller for cellens potentiale til at differentiere sig til en bestemt slægt. Vi har for nylig offentliggjort en protokol til effektiv siRNA-medieret forlænget genudryddelse i AFS-celler . Denne protokol, som vi allerede har afprøvet for en række forskellige gener, giver mulighed for en 96-98 % nedregulering af den endogene genekspression over en periode på ca. 14 dage i AFS-celler og i en række andre primære, immortaliserede eller transformerede celler .
For nylig har vi gjort brug af denne fremgangsmåde til at undersøge mTOR-vejens rolle i humane AFS-celler. Deregulering af opstrømsregulatorer af mTOR, såsom f.eks. Wnt, Ras, TNF-α, PI3K eller Akt, er et kendetegn i mange humane kræftformer. Mutationer i mTOR-banekomponentgenerne TSC1, TSC2, LKB1, PTEN, VHL, NF1 og PKD1 udløser udviklingen af de humane genetiske syndromer: tuberøs sklerose, Peutz-Jeghers-syndromet, Cowden-syndromet, Bannayan-Riley-Ruvalcaba-syndromet, Lhermitte-Duclos-syndromet, Proteus-syndromet, von Hippel-Lindau-syndromet, neurofibromatose type 1 og polycystisk nyresygdom. Ud over en række enkeltgenforstyrrelser og tumorigenese har mTOR-vejen også vist sig at være relevant for udviklingen af komplekse sygdomme som f.eks. hjertehypertrofi, fedme og type 2-diabetes. Alle disse patologiske konsekvenser af dereguleret mTOR-aktivitet kan forklares i betragtning af, at mTOR er den vigtigste komponent i insulinsignalkaskaden, som er involveret i en lang række forskellige processer såsom cellevækst, proliferation, metabolisme, transkription, translation, overlevelse, autofagi, aldring, differentiering og onkogenese . Vi fandt, at hele processen med dannelse af embryoid body i AFS-celler afhænger af begge mTOR-holdige enzymer, mTORC1 og mTORC2 . Som nævnt ovenfor viste modulering af mTOR-komponenter via specifikke siRNA-tilgange, at AFS-cellernes potentiale til at bidrage til nyrevævsdannelse reguleres af denne signalvej . For nylig har tilgangen til at nedbryde endogene genfunktioner i AFS-celler gjort det muligt for os at påvise, at de to mTOR-regulatorer, tuberin og PRAS40, er antiapoptotiske gatekeeper under den tidlige humane AFS-celledifferentiering . Samlet set er vi overbevist om, at metoden med siRNA-medieret knockdown af endogen genekspression i monoklonale humane AFS-cellelinjer er et meget effektivt redskab til fremtidige projekter, der beskæftiger sig med den molekylære regulering af differentiering .
Et andet meget interessant aspekt for fremtidig grundforskning er at opbygge banker med AFS-cellelinjer, der bærer naturligt forekommende mutationer, som er relevante for visse patologiske fænotyper hos mennesker. Inden for den medicinske genetik afhænger den fremtidige udvikling af nye profylaktiske og terapeutiske strategier direkte af en bedre forståelse af de mekanismer, hvormed naturligt forekommende genetiske variationer bidrager til sygdom . I lande, hvor det er lovligt at anvende menneskelige embryoner til forskning, genereres ES-cellelinjer med visse arvelige defekter fra embryoner med alle former for numeriske kromosomale abnormiteter eller specifikke monogene sygdomsmutationer, der er udelukket fra overførsel til livmoderen efter præimplantationsgenetisk diagnose . Der er også allerede blevet genereret en række iPS-linjer fra enkeltgenforstyrrelser, kromosomsyndromer og komplekse sygdomme med henblik på at anvende dem til grundforskningsprojekter . Som allerede drøftet i detaljer har både ES-celler og iPS-celler dog relevante ulemper i forhold til AFS-celler. Ud over andre invasive metoder er fostervandsprøve en bredt accepteret standardprocedure inden for prænatal pleje siden 1970’erne. Det er næsten uoverskueligt, hvor mange fostervandsprøver der foretages om året på verdensplan. Samlet set mener vi, at generering og opbevaring af normale humane AFS-cellelinjer og AFS-cellelinjer med kromosomale aberrationer samt AFS-cellelinjer med specifikke monogene sygdomsmutationer kan give meget effektive værktøjer til sygdomsmodellering i fremtidig forskning. Her er det vigtigt at bemærke, at det er noget helt andet at opbevare AFS-celler til ikke-forskningsmæssige formål med det formål at beskytte et barns sundhed ved at have stamceller til rådighed i hele dets levetid. Nogle virksomheder i Europa og USA tilbyder allerede nu at lægge AFS-celler i banker, når der f.eks. foretages en fostervandsprøve med henblik på prænatal diagnose. Deres argumenter for at bevare AFS-celler er, at disse celler en gang kunne hjælpe med at behandle skader (f.eks. reparation af brusk i knæet), helbrede sår eller udvikle hud til specifikke transplantationer. Som tidligere nævnt er der i fremtiden behov for omfattende forskning for at fastslå den formodede kliniske anvendelse af AFS-stamceller hos mennesker. De lovende resultater, der er opnået i løbet af de sidste par år inden for dette stadig unge videnskabelige område, berettiger klart til yderligere detaljerede undersøgelser af den mulige kliniske anvendelse af AFS-celler. I denne artikel vil vi gerne understrege, at bankopbevaring af AFS-celler med naturligt forekommende mutationer med henblik på humangenetisk forskning bør påbegyndes så hurtigt som muligt i forskellige laboratorier under sammenlignelige kvalitetsstandarder. Det ville være værd at tilskynde forskellige laboratorier til at udtage prøver af fostervand fra fostervandsprøver med sammenlignelige indikationer fra lignende uger af graviditeten. Protokollerne til isolering af stamceller, minimumsfortyndinger og karakterisering af de således opnåede monoklonale AFS-cellelinjer bør standardiseres. Biobanker af AFS-cellelinjer med karakteriserede mutationer vil gøre det muligt at gå videre til næste trin i den humangenetiske forskning ved hjælp af humane stamceller .