Resultater og diskussion
To metoder til DNA-spaltning af R.KpnI i tilstedeværelse af Mg2+.
R.KpnI er en meget promiskuøs REase i Mg2+-katalyserede reaktioner i modsætning til de fleste andre REaser (11, 12). I fig. 1 A er det karakteristiske spaltningsmønster af R.KpnI vist i et interval af Mg2+-koncentrationer. Ved lavere koncentrationer af metalionen (50-500 μM) blev der kun observeret spaltning af den beslægtede sekvens (baner 2-5). Ved koncentrationer af Mg2+ >500 μM blev der imidlertid konstateret promiskuøs spaltning (lanes 6-9). De specifikke og promiskuøse spaltningsformer ved R.KpnI afhængigt af Mg2+-koncentrationen blev underbygget ved analyse af spaltningen af oligonukleotider. Oligonukleotid-substratet, der indeholder den kanoniske sekvens, blev effektivt spaltet af R.KpnI selv ved 20 μM Mg2+. I modsætning hertil blev ikke-kanoniske sekvenser kun spaltet effektivt ved >500 μM Mg2+ . Disse resultater tyder på, at R.KpnI udviser to forskellige metalaktiveringsprofiler – en for kanoniske og en anden for ikke-kanoniske DNA-substrater. Enzymet følger en hyperbolisk metalaktiveringsprofil for det kanoniske substrat og et sigmoidalt mønster for det ikke-kanoniske substrat (fig. 1 B). Disse data blev underkastet Hill-plot-analyse (Fig. S2; og se SI-tekst ), og Hill-koefficienten for metalionbindingen er præsenteret i tabel 1. Hill plot-analysen afslørede bindingen af yderligere metalioner til enzymet og dets rolle i spaltningen af ikke-kanoniske sekvenser. Rekrutteringen af en ekstra metalion nær eller fjernt fra enzymets aktive sted syntes således at være nødvendig for at inducere promiskuøs spaltning af enzymet. Hvis det er tilfældet, bør mutation af de rester, der er involveret i metalionkoordinationen på det andet sted, afskaffe den promiskuøse aktivitet, hvilket resulterer i et meget sekvensspecifikt enzym. Vi testede denne hypotese.