DISCUSSION
Citrobacter er en væsentlig årsag til opportunistiske infektioner; C. diversus er forbundet med ca. 40% af de aktuelle tilfælde, mens C. freundiirepresenterer ca. 29% (11). Citrobacterspp. forårsager neonatal meningitis og har en usædvanlig tilbøjelighed til at forårsage hjerneabscesser (8, 14). Patogenesen forCitrobacter spp. der forårsager meningitis og hjerneabscesser er ikke velkarakteriseret; som det er tilfældet med andre meningitisfremkaldende bakterier, må der dog ske en penetration af blod-hjernebarrieren. Denne undersøgelse blev foretaget for bedre at forstå de potentielle interaktioner mellemCitrobacter og blod-hjerne-barrieren. C. freundii blev valgt som modelbakterie til disse undersøgelser, fordi bakteriens genetik er bedre defineret, og der er et genomisk bibliotek til rådighed til eventuelle undersøgelser af det molekylære grundlag forCitrobacter-invasion og -replikation i HBMEC. Eksperimenter udført med et cerebrospinalvæskeisolat af C. diversus gav lignende resultater (data ikke vist), hvilket tyder på, at frekvensen og mekanismen for HBMEC-invasion for disse to arter kan være ens.
Blod-hjernebarrieren er en kompleks struktur, der består af choroid plexus-epitelet og hjernens kapillærendothelium. Tilstedeværelsen af tætte junctions og lav pinocytotisk aktivitet for endothelcellerne resulterer i en begrænsning af makroelementer, der passerer gennem blod-hjernebarrieren. På nuværende tidspunkt vides det ikke, hvor i blod-hjernebarrieren C. freundii trænger ind, men det blev konstateret, at choroid plexus sjældent var involveret i spædbarnsrotte-modellen af eksperimentel hæmatogen Citrobacter-meningitis (16). Desuden dækker de endotheliale mikrovaskulære celler det største overfladeareal af blod-hjernebarrieren, og andre meningitisfremkaldende bakterier har vist sig at invadere mikrovaskulære endothelceller in vitro (13, 20, 25). Vi valgte derfor HBMEC til vores undersøgelse. Vævskulturinvasionstest og TEM-undersøgelser gav beviser for, at C. freundii invaderer HBMEC. Resultater fra invasionsassays udført i tilstedeværelse af forskellige eukaryote celleinhibitorer tyder på, at invasionen af C. freundii i HBMEC er en mikrofilament-, mikrotubulus-, de novo-proteinsyntese- og endosomforsuringsafhængig proces. Ved udvidede invasionsforsøg blev det fastslået, at C. freundii kan overleve og replikere intracellulært i længerevarende perioder in vitro. TEM-analyser afslørede den intracellulære placering af individuelle og multiple C. freundii-celler inden for enkeltmembranvakuole-lignende strukturer. Transwell-eksperimenter viste, at C. freundii kunne krydse et polariseret monolag af HBMEC, mens ikke-invasiv E. coli ikke kunne. Desuden viser vores foreløbige data, at C. freundii trænger gennem blod-hjernebarrieren i den neonatale rottemodel af eksperimentel hæmatogen meningitis (21). Tilsammen tyder disse resultater på, at C. freundii invaderer vacuoler, muligvis replikerer, transcytoserer gennem HBMEC, frigives i den basolaterale side og således trænger igennem blod-hjernebarrieren.
Invasion af eukaryote celler med C. freundii er blevet rapporteret (22, 35). Dette er imidlertid den første rapport om invasion af HBMEC af C. freundii. Underligt nok er de eukaryotiske krav til C. freundiis invasion lige så forskellige som de celletyper, som C. freundii har vist sig at invadere. For eksempel har den clathrinbelagte pit-inhibitor MDC vist sig at hæmme C. freundiis invasion i alle andre celletyper, der er undersøgt (f.eks. humane vaskulære, intestinale og blæreepitelceller) undtagen, som vist i denne undersøgelse, i HBMEC. Desuden trænger andre meningitis-fremkaldende bakterier, der hidtil er karakteriseret, ind i HBMEC ad en eller flere ruter, der er afhængige af mikrotubuli og er MDC-følsomme (20, 24, 27). Clathrin-coated pit-inhibitorer MDC og ouabain har ikke vist sig at hæmme alle receptorer; det kan således være, at den receptor, der er nødvendig for C. freundii’s invasion af HBMEC, ikke påvirkes af inhibitoren MDC eller ouabain. Selv om de hidtil indsamlede beviser tyder på, at C. freundiis indtrængen i HBMEC måske ikke sker via en MDC- eller ouabain-sensitiv receptormedieret rute, ser det ud til, at både endosomforsuring og de novo-proteinsyntese er nødvendige. De foreliggende data tyder på to mulige scenarier. Endosomforsuring kan være nødvendig som en miljømæssig udløsende faktor for intracellulær bakteriel overlevelse. Lignende krav er blevet karakteriseret for Salmonella epithelial invasion (26). Alternativt kan endosomforsuring og proteinsyntese være nødvendige for adskillelse af ligand-receptorkomplekset, syntese af receptor og/eller præsentation af receptor på HBMEC-overfladen, for at C. freundii kan invadere. Sidstnævnte scenario minder om andre invasive patogener, hvor kontakt med den levedygtige organisme er nødvendig for at modulere eukaryote celleadhæsionsmolekyler, der er nødvendige for invasion (f.eks. Streptococcus pneumoniae og receptoren for platelet-aktiverende faktor) (2). Eksperimenter er i gang i vores laboratorium for at skelne mellem disse foreslåede scenarier.
Invasionstest udført i tilstedeværelse af mikrotubulusinhibitorer (både depolymeriserende og stabiliserende midler) mindskede HBMEC’s evne til at optage C. freundii betydeligt. Konfokal mikroskopiforsøg med anti-α-tubulin antistoffer viste, at mikrotubuli aggregeres efter HBMEC kommer i kontakt med C. freundii. Aggregeringen af mikrotubuli var en tidsafhængig proces; der blev ikke set nogen aggregering efter 5 minutter, kun lidt efter 15 minutter, og der blev observeret en tydelig aggregering efter 30 minutters inkubation af C. freundii med HBMEC. Denne mikrotubulusaggregation blev hæmmet, når cellerne blev behandlet med enten mikrotubulusinhibitorer eller mikrofilamenthæmmende midler. Det er interessant, at mikrotubuli-aggregationsfarvningsmønstret ikke kolokaliserede med bakteriebinding, og områder af HBMEC, som ikke viste C. freundii-binding, viste også udtalt mikrotubuli-klumpning. Dette tyder på, at bakteriernes kontakt med HBMEC globalt set kan stimulere mikrotubulusaggregation. Det er endnu uvist, om mikrotubulusaggregationen er et resultat af en sekretorisk bakteriefaktor eller et parakrint respons på bakteriernes binding til HBMEC. Endvidere kan aggregeringen af mikrotubuli som reaktion på C. freundii-binding være relateret til den postulerede receptorpræsentation via de novo-proteinsyntese og endosomforsuring. Det er tidligere blevet vist, at transporten af mange receptorer til og fra celleoverfladen er afhængig af mikrotubuli (10). En forklaring på den hæmmende virkning af mikrotubulusinhibitorer på C. freundiis indtrængen i HBMEC er derfor, at midlerne kan mindske antallet af HBMEC-receptorer, der formidler C. freundiis indtrængen. Der er forsøg i gang for at skelne mellem disse muligheder.
Mikrotubuli har tidligere vist sig at være nødvendige for invasion af mange patogener (f.eks. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropatogen og enterohæmorrhagisk E. coli og Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Den generelle opfattelse har været, at selv om disse patogener kan trænge ind gennem mikrotubulusafhængige veje, replikerer de normalt ikke intracellulært (6). De data, der er opnået i denne undersøgelse fra udvidede invasionsassays og TEM-analyse, tyder på, atC. freundii kan være en undtagelse fra denne generalisering. I modsætning til hvad der er blevet beskrevet for en anden intravacuole-replikerende bakterie, Legionella pneumophila(12), var der ingen mitokondrier eller ribosomer i umiddelbar nærhed af bakterierne. Dette tyder på, at C. freundii måske ikke bruger disse organeller til direkte at skaffe energi, eller at rekruttering af specifikke værtscelleproteiner måske ikke er nødvendig for intracellulær overlevelse og proliferation (som i tilfældet med L. pneumophila). Af særlig relevans for infektioner i centralnervesystemet er andre meningitisfremkaldende bakterier som E. coli K1, GBS og S. pneumoniae ligeledes blevet vist at invadere (1, 13, 25) eller invadere og transcytose (20, 27) BMEC; det er imidlertid ikke blevet konstateret, at disse organismer replikerer i HBMEC. Som beskrevet ovenfor er Citrobacter-meningitis blevet dokumenteret for sin høje frekvens af hjerneabscessedannelse. Hvorvidt replikation inden for HBMEC-vacuoler er unik for Citrobacter, og om der er en sammenhæng med abscesdannelse, er endnu ikke fastlagt.
Cytochalasin D hæmmer C. freundii invasion i HBMEC; ved hjælp af immunfarvning fandt vi imidlertid ingen påviselig reorganisering af mikrofilamenter, når C. freundii interagerede med HBMEC (data ikke vist). Desuden hindrede cytochalsin D-forbehandling af HBMEC den bakterieafhængige mikrotubulusaggregation, som visualiseret ved konfokal mikroskopi. Der kan være flere forklaringer på disse resultater. Cytochalsin D’s virkning på den bakterieafhængige mikrotubulusaggregation kan skyldes indirekte virkninger af mikrofilamenthæmmeren på mikrotubuli-netværket. For eksempel er det blevet observeret, at mikrotubuli fungerer som forankringsstrukturer for F-actin (28). Derfor kan en forstyrrelse af mikrofilamentnetværket påvirke mikrotubuli-netværket og dermed indirekte påvirke den mikrotubuli-afhængige C. freundii-invasion af HBMEC. Alternativt kan et actinafhængigt invasionstrin gå forud for et mikrotubulusafhængigt trin i C. freundii-invasionen af HBMEC. Dette indledende trin kan resultere i en reorganisering af mikrofilamenter, når bakterierne i første omgang er i kontakt med HBMEC; disse hændelser kan dog være forbigående, og det eksperimentelle design, der anvender immunofluorescensmikroskopi, er muligvis ikke tilstrækkelig til at påvise deres forekomst. En lignende situation er konstateret for Yersiniainvasin-medieret invasion (36). Hvis de indledende invasionsfaser forhindres af cytochalasin D, udløses de efterfølgende invasionsfaser, som er mikrotubulusafhængige, derfor ikke. Det er tidligere blevet vist, at actin fungerer i translokationen af actinbindende proteinfaktorer til plasmamembranen samt i den cytosoliske signalering (19). Desuden hæmmer cytochalasin D Salmonellas indtrængen via afbrydelse af translokationen af aktinbindende proteiner til bakteriens indtrængningssted (7). Det er muligt, at i tilfælde af C. freundii-invasion af HBMEC er aktin-mikrofilamenter nødvendige for cytosolisk signalering og/eller bakterieindtrængning ved plasmamembranen, og mikrotubuli kan være nødvendige for transport af membranbundne bakterier fra plasmamembranen mod den basolaterale side (eller blot dybere ind i cellen). En afbrydelse på et af invasionens to stadier ville således resultere i en “trafikprop.”
Sammenfattende viser de her præsenterede resultater, at C. freundii kan invadere, formere sig i og transcytose HBMEC in vitro. Bestemmelse af det genetiske grundlag for disse fænotyper vil give en betydelig indsigt i patofysiologien ved Citrobactermeningitis og potentielt hjælpe med at udvikle nye terapeutiske og forebyggende strategier. Desuden kan en omfattende molekylær sammenlignende analyse af Citrobacter med andre meningitisfremkaldende bakterier kaste lys overCitrobacter’s unikke egenskab ved dannelse af hjerneabscesser.