Back to Basics – Hvad er et immunoassay – Downloadable PDF Version
Hvad er et immunoassay eller ELISA?
Immunoassays er hurtige og nøjagtige test, der kan bruges på stedet og i laboratoriet til at påvise specifikke molekyler. Immunoassays er baseret på et antistofs iboende evne til at binde sig til den specifikke struktur af et molekyle. Antistoffer er proteiner, der dannes af dyr som reaktion på, at et fremmed molekyle (antigen) trænger ind i kroppen. Antistoffer findes i blod og vævsvæsker og vil binde sig til antigenet, når det støder på det. Da antistoffer er udviklet til den specifikke tredimensionelle struktur af et antigen eller en analysand, er de meget specifikke og vil kun binde sig til denne struktur. Når de er renset fra blodet, er monoklonale og polyklonale antistoffer ideelle reagenser til at påvise og overvåge specifikke målmolekyler med begrænset interferens fra andre stoffer. Fire typiske ELISA-formater er: antistof-sandwich-immunoassays, antigen-down-immunoassays, kompetitive hæmningsassays og hurtige assays.
Antistof-sandwich-immunoassay
I et typisk antistof-sandwich-immunoassay adsorberes et monoklonalt antistof på en mikrotiterplade af plast. Når testprøven tilsættes til pladen, vil antistoffet på pladen binde målantigenet fra prøven og fastholde det i pladen. Når et polyklonalt antistof tilsættes i det næste trin, binder det også til målantigenet (som allerede er bundet til det monoklonale antistof på pladen), hvorved der dannes en antigen-“sandwich” mellem de to forskellige antistoffer.
– Trin 1: Monoklonale antistoffer adsorberes på brønden af en mikrotiterplade af plast med belægningsbuffer (ingen prøve tilsat).
– Trin 2: Tilsætning af en prøve (f.eks. menneskeblod, passende fortyndet) til brønden af mikrotiterpladen. Målantigenet binder sig til det antistof, der er adsorberet på pladen, hvorved antigenet holdes tilbage i brønden.
– Trin 3: Et enzymkonjugeret polyklonalt antistof bindes til målantigenet (bundet til det monoklonale antistof på pladen), hvorved der dannes en antigen-“sandwich” mellem de to forskellige antistoffer.
– Trin 4: Tilsætning af et kolorimetrisk substrat til detektion af de enzymkonjugerede polyklonale antistoffer vil generere et farvesignal, der er proportionalt med mængden af målantigen, der er til stede i den oprindelige prøve, som er tilsat til pladen.
Antigen-down (immunitetstest)-immunoassay
I et antigen-down (immunitetstest)-immunoassay er analysanden belagt, der anvendes til at binde antistoffer, der findes i en prøve. Når prøven tilsættes (f.eks. humant serum), bindes antigenet på pladen af antistoffer (f.eks. IgE) fra prøven, som derefter fastholdes i brønden. Derefter tilsættes et artsspecifikt antistof (f.eks. anti-human IgE) mærket med HRP, som binder sig til det antistof, der er bundet til antigenet på pladen. Jo højere signalet er, jo flere antistoffer er der i prøven. Antigen-down-assays (immunitetstest) kan konfigureres som hurtige test og bruges ofte til at diagnosticere allergitilstande – rutinemæssigt testes en patients blod mod forskellige allergener for at se, om personen har antistoffer mod det pågældende allergen.
Kompetitive hæmningsimmunoassay
Ud over det monoklonale-polyklonale (Mo-Po) antistofsandwichformat er mange immunoassays struktureret i et kompetitivt hæmningsformat. Konkurrencehæmmende hæmningsassays anvendes ofte til måling af små analytter, fordi kompetitive hæmningsassays kun kræver binding af ét antistof i stedet for to, som i standard ELISA-formater. På grund af den store sandsynlighed for sterisk hindring, der opstår, når to antistoffer forsøger at binde til et lille molekyle på samme tid, er det ikke altid muligt at anvende et sandwich-assayformat. I en sekventiel kompetitiv hæmningsassay tilsættes prøven og den konjugerede analysand i trin som i en sandwich-assay, mens disse reagenser i en klassisk kompetitiv hæmningsassay inkuberes sammen på samme tid i en klassisk kompetitiv hæmningsassay. I et sekventielt kompetitivt hæmningsassay-format er et monoklonalt antistof belagt på en mikrotiterplade med 96 brønde. Når prøven tilsættes, fanger MoAb’et fri analysand ud af prøven. I næste trin tilsættes en kendt mængde analyt, der er mærket med enten biotin eller HRP. Den mærkede analyt vil derefter også forsøge at binde sig til MoAb, der er adsorberet på pladen, men den mærkede analyt hæmmes i at binde sig til MoAb af tilstedeværelsen af den tidligere bundne analyt fra prøven. Det betyder, at den mærkede analysand ikke vil blive bundet af monoklonalstoffet på pladen, hvis monoklonalstoffet allerede har bundet den umærkede analysand fra prøven. Mængden af umærket analyt i prøven er omvendt proportional med det signal, der genereres af den mærkede analyt. Jo lavere signalet er, jo mere umarkeret analyt er der i prøven. Der kan opstilles en standardkurve ved hjælp af serielle fortyndinger af en umærket analytstandard. Efterfølgende prøveværdier kan derefter aflæses på standardkurven, som det er tilfældet i sandwich-ELISA-formatet. Det klassiske kompetitive hæmningsassayformat kræver samtidig tilsætning af mærket (konjugeret analysand) og umærket analysand (fra prøven). Både den mærkede og den umærkede analysand konkurrerer så samtidig om bindingsstedet på det monoklonale opsamlingsantistof på pladen. Ligesom det sekventielle kompetitive hæmningsformat er det farvede signal omvendt proportionalt med koncentrationen af umærket målanalyt i prøven. Påvisning af den mærkede analyt kan ske ved hjælp af et peroxidasesubstrat, f.eks. TMB, som kan aflæses på en mikrotiterpladelæser.
Snelligt immunoassay
Ud over mikrotiterplader er immunoassays også konfigureret som hurtige tests, f.eks. en graviditetstest i hjemmet. Ligesom mikrotiterpladeassays anvender hurtige test antistoffer til at reagere med antigener og kan udvikles som MoAb-PoAb-sandwichformater, kompetitive inhiberingsformater og antigen-down-formater. Ved en hurtigtest er antistof- og antigenreagenset bundet til porøse membraner, som reagerer med positive prøver, mens overskydende væsker ledes til en ikke-reaktiv del af membranen. Hurtige immunoassays findes almindeligvis i to konfigurationer: en lateral flow-test, hvor prøven blot anbringes i en brønd, og resultaterne aflæses straks, og et gennemstrømningssystem, som kræver, at prøven anbringes i en brønd, brønden vaskes og til sidst tilsættes et konjugat af analytisk kolloidal guld, og resultatet aflæses efter nogle få minutter. Der testes én prøve pr. strimmel eller kassette. Da hurtige test er hurtigere end mikrotiterpladeanalyser, kræver kun lidt prøvebehandling, ofte er billigere og giver ja/nej-svar uden brug af et instrument, anvendes de ofte i marken af personer, der ikke arbejder på laboratorier, og som tester hele prøver. Hurtige immunoassays er imidlertid ikke lige så følsomme og kan heller ikke anvendes til nøjagtig kvantificering af en analysand (diabetikeres selvkontrol af blodglukoseniveauet betragtes som kvantitativ hurtig testning, men immunoassayteknologi anvendes ikke til disse test). Alle hurtige immunoassay-tests kan konverteres til et mikrotiterpladeassay, men ikke alle mikrotiterpladeassays kan konverteres til en hurtig test.
