Omkring år 1000 f.Kr. bosatte en bølge af indvandrere sig i den øvre Tiber-dal helt ud til Adriaterhavet og også i nærheden af Assisi. Det var umbrerne, som boede i små befæstede bosættelser på højtliggende områder. Fra 450 f.Kr. blev disse bosættelser gradvist overtaget af etruskerne. Romerne overtog kontrollen med det centrale Italien efter slaget ved Sentinum i 295 f.Kr. De byggede det blomstrende municipium Asisium på en række terrasser på Monte Subasio. Der findes stadig romerske levn i Assisi: bymure, forum (nu Piazza del Comune), et teater, et amfiteater og Minerva-templet (nu omdannet til Santa Maria sopra Minerva-kirken). I 1997 opdagede man også resterne af en romersk villa med flere velbevarede rum med fresker og mosaikker i en stand, som man sjældent finder uden for steder som Pompei.
I 238 e.Kr. blev Assisi omvendt til kristendommen af biskop Rufino, der blev martyrdød i Costano. Ifølge traditionen hviler hans jordiske rester i katedralkirken San Rufino i Assisi.
Ostgoterne under kong Totila ødelagde det meste af byen i 545. Assisi kom derefter under langobardernes herredømme som en del af det langobardiske og derefter frankiske hertugdømme Spoleto.
Den blomstrende kommune blev en uafhængig gibellinsk kommune i det 11. århundrede. Den kæmpede konstant med det guelfiske Perugia, og det var under et af disse slag, slaget ved Ponte San Giovanni, at Francesco di Bernardone (Sankt Frans af Assisi) blev taget til fange, hvilket satte gang i de begivenheder, der i sidste ende førte til, at han levede som tigger, gav afkald på verden og stiftede ordenen af mindre brødre.
Byen, der var forblevet inden for de romerske murers grænser, begyndte at udvide sig uden for disse mure i det 13. århundrede. I denne periode var byen under pavelig jurisdiktion. Rocca Maggiore, den kejserlige fæstning på toppen af bakken over byen, som var blevet plyndret af befolkningen i 1189, blev genopbygget i 1367 på ordre fra den pavelige legat, kardinal Gil de Albornoz.
I begyndelsen faldt Assisi under Perugias herredømme og senere under flere despoter, som f.eks. lykkesoldaten Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti og hans efterfølger Francesco I Sforza, hertuger af Milano, Jacopo Piccinino og Federico II da Montefeltro, herre af Urbino. Byen gik i dyb forfald på grund af pesten under den sorte død i 1348.
Byen kom igen under pavelig jurisdiktion under pave Pius II (1458-1464).
I 1569 blev byggeriet af basilikaen Santa Maria degli Angeli påbegyndt. Under renæssancen og i de senere århundreder fortsatte byen med at udvikle sig fredeligt, hvilket Bernabei og Giacobetti’s palazzi fra det 17. århundrede vidner om.
Nu er Assisi stedet for mange pilgrimsrejser og er i legenden forbundet med sin fødesøn, den hellige Frans. Den blide helgen grundlagde franciskanerordenen og deler æren med den hellige Katharina af Siena som Italiens skytshelgen. Han huskes af mange, selv ikke-kristne, som en naturelsker (hans prædiken for et publikum af fugle er en af legenderne om hans liv).
Assisi blev ramt af to ødelæggende jordskælv, der rystede Umbrien i september 1997. Men genopretningen og restaureringen har været bemærkelsesværdig, selv om der stadig er meget, der skal gøres. Der skete massive skader på mange historiske steder, men den største attraktion, Basilica di San Francesco, blev genåbnet mindre end 2 år senere.