En opslæmning af harpiks, f.eks. DEAE-Sephadex, hældes i kolonnen. Den matrix, der anvendes, er uopløselig med ladede grupper, der er kovalent knyttet. Disse ladede grupper betegnes som udvekslere, f.eks. kation- og anionbyttere. Efter at søjlen har sat sig, præ-equilibreres den i buffer, inden proteinblandingen påføres. DEAE-Sephadex er en positivt ladet opslæmning, som vil have elektrostatiske vekselvirkninger med de negativt ladede atomer, hvilket gør, at de elueres senere end de positivt ladede molekyler i den pågældende prøve. Dette er en separationsteknik, der anvendes i vid udstrækning til at finde specifikke proteiner eller enzymer i kroppen. Ubundne proteiner opsamles i gennemstrømningen og/eller i efterfølgende buffervaskninger. Proteiner, der binder sig til den positivt ladede harpiks, bliver tilbageholdt og kan elueres på en af to måder. For det første øges saltkoncentrationen i elueringsbufferen gradvist. De negative ioner i saltopløsningen (f.eks. Cl-) konkurrerer med proteinerne om at binde sig til harpiksen. For det andet kan opløsningens pH-værdi gradvist sænkes, hvilket resulterer i en mere positiv ladning på proteinet, hvorved det frigøres fra harpiksen. Begge disse teknikker kan fortrænge det negativt ladede protein, som derefter elueres i reagensglasfraktioner med bufferen.
Separationen af proteinerne vil afhænge af forskellene i den samlede ladning. Sammensætningen af ioniserbare sidekædegrupper vil bestemme proteinets samlede ladning ved en bestemt pH-værdi. Ved det isoelektriske punkt (pI) er proteinets samlede ladning 0, og det vil ikke binde sig til matrixen. Hvis pH-værdien er højere end pI-værdien, vil proteinet have en negativ ladning og binde sig til matrixen i en anionbyttersøjle. Proteinets stabilitet ved værdier over eller under pI-værdien er afgørende for, om der skal anvendes en anionbyttersøjle eller en kationbyttersøjle. Hvis det er stabilt ved pH-værdier under pI-værdien, skal der anvendes en kationbyttersøjle. Hvis det er stabilt ved pH-værdier over pI-værdien, kan anionbyttersøjlen anvendes.