FPE vs. zmrazená tkáň se budeme zabývat v tomto článku. Lékařský výzkum rakoviny a dalších onemocnění vyžaduje přístup k jedinečným nástrojům a materiálům – včetně vzorků ke studiu. Pokud například zkoumáte tvar a strukturu buněk (morfologii), chorobné stavy, vnitrobuněčnou a mezibuněčnou komunikaci nebo související témata, je nesmírně užitečné mít přístup ke spolehlivým řezům bioptované tkáně. Vzhledem k tomu, že většina biologických materiálů je křehká a podléhá zkáze, je třeba dbát na jejich správnou přípravu a uchování. V současnosti se používají dvě hlavní metody přípravy tkání. Po desetiletí se tkáně napouštějí formalínem (tzv. formaldehydem) a poté se vkládají do bloku parafínu (označují se jako tkáně fixované formalínem a vložené do parafínu nebo FFPE). S příchodem spolehlivých mrazniček na ultranízké teploty a bohatých zásob kapalného dusíku je možné tkáň zmrazit jako druhý způsob dlouhodobého skladování. Každá z těchto dvou metod má své výhody i nevýhody. Níže je uvedeno srovnání silných a slabých stránek těchto dvou metod uchovávání.
TkáněFFPE
Formalinem fixované tkáně vložené do parafínu jsou nejběžnějším zdrojem archivovaného materiálu. Nemocniční patologové vytvářejí a archivují FFPE tkáně již desítky let. Kdykoli studují biopsii odebranou pacientovi, archivují část tohoto materiálu pro pozdější použití – někdy se k němu vracejí nebo získávají další názory v průběhu léčby pacienta. Vědci také uchovávají darované tkáně lidí nebo materiály odebrané zvířatům, aby vytvořili archivy materiálů pro pozdější studium. Tyto archivy se nazývají „biobanky“ a mohou je vytvářet univerzity a nemocnice nebo je pro komerční účely vytvářejí společnosti, které slouží výzkumné komunitě. Výsledkem těchto činností je dostupnost rozsáhlých sbírek materiálu pro následné studium. Vzhledem k tomu, že tyto archivy byly vytvářeny po velmi dlouhou dobu, mohou nabídnout historickou perspektivu, stejně jako jsou jednoduše hojným zdrojem výzkumného materiálu. Vzhledem k tomu, že tkáň FFPE lze skladovat ve skříni při pokojové teplotě, je levné vytvořit rozsáhlou sbírku, která bude stabilní po velmi dlouhou dobu. Formalín a vosk zachovávají křehké struktury uvnitř tkáně a mezi buňkami – díky tomu je tkáň FFPE skvělá pro lidi, kteří zkoumají morfologii buněk a tkání – například pro patology, kteří studují zachované biopsie za účelem diagnostiky rakoviny. V tkáni FFPE jsou zachovány také proteiny, nejen struktury viditelné pod mikroskopem. Histologové mohou používat fluorescenčně značené protilátky (nebo protilátky značené jinými prostředky), které se specificky vážou na určité proteiny, aby zjistili, zda jsou přítomny v určitých buňkách tkání a zda se umístění a množství těchto proteinů liší v nemocných a zdravých tkáních. Tato metoda se označuje jako imunohistochemie (IHC). A konečně, protože FFPE je stará a zavedená metoda skladování tkání, patologové jsou zvyklí vyšetřovat biopsie tkání FFPE a stanovovat z nich diagnózy. Pokud se chcete dozvědět více, přečtěte si náš příspěvek na blogu o tom, co je tkáň FFPE a jaké je její použití.
Nevýhody tkáně FFPE
Formalin je těkavý, toxický a hrozně zapáchá. Většina postupů vkládání a fixace parafínu je také pracná a časově náročná. Navíc jsou sice zachovány proteiny, ale zároveň jsou denaturovány. Nejsou již biologicky aktivní. Také se nemusí vázat na stejné protilátky jako nedenaturované (nebo nativní) verze stejných proteinů. To může poněkud omezit jejich hodnotu pro určité typy studií IHC a učinit je nepoužitelnými pro biochemickou analýzu. Dalším problémem je, že nukleové kyseliny (DNA a RNA) v tkáni FFPE nejsou příliš dobře zachovány. Nukleové kyseliny lze sice z tohoto typu zachované tkáně izolovat, ale jejich použitelnost může být omezená. Proto nemusí být tkáň FFPE vždy vhodná pro molekulárně genetickou analýzu. A konečně, většina protokolů FFPE není standardizována. To znamená, že není zaručeno, že vzorky odebrané v různých dobách nebo na různých místech byly připraveny podobně. Nestandardizované metody přípravy mohou neúměrně ovlivnit výsledky z nich získané – zejména v případě molekulárně genetické analýzy. Určitou molekulární analýzu lze provést, ale mnoho se ztratí, pokud se tkáň uchovává metodou FFPE.
Tkáně zmrazené
Mrazené tkáně naopak fungují pro molekulárně genetickou analýzu velmi dobře – zejména pokud se bioptický materiál ponoří do tekutého dusíku metodou zvanou „bleskové zmrazení“ a poté se uchovává v ultrachladném mrazáku při teplotě nižší než -80 stupňů Celsia. Pokud tedy máte k dispozici mrazák „-80“ a tekutý dusík, lze snadno připravit čerstvě zmrazené tkáně. Zmrazené vzorky tkáňových matric jsou také velmi užitečné pro analýzu IHC, protože proteiny jsou zachovány v nativním stavu. Tyto „nativní“ nedenaturované proteiny lze také izolovat v dosud aktivní formě pro biochemickou analýzu. Tkáň však při pokojové teplotě rychle degraduje a při skladování v běžnějším potravinářském nebo domácím mrazáku „-20“ se špatně uchovává. Musíte ji co nejdříve zmrazit a poté uchovávat ve velmi nízké teplotě. V případě bioptické tkáně to může být obtížné, protože chirurgové nemusí mít po ruce tekutý dusík k bleskovému zmrazení vyříznutého nádorového materiálu. K tomu, abyste mohli tkáň udržovat stále zmraženou, je také zapotřebí speciální mraznička s velmi nízkou teplotou. Archivy zmrazených tkání jsou vždy náchylné k výpadkům proudu nebo mechanickým poruchám. Bezstarostní technici také mohou nechat cenné vzorky na laboratorních stolech nebo zapomenout zavřít dveře mrazničky. A konečně, biobanky jako novější metoda mají obecně menší sbírky zmrazených tkání.
Shrnutí FFPE VS zmrazené tkáně
Shrnem lze říci, že tkáně FFPE jsou vhodné pro vytváření velkých archivů tkání pro výzkum. Po přípravě je tkáň FFPE velmi odolná. Nepotřebuje speciální vybavení, které by ji udrželo stabilní po desítky let. Patologové stanovují diagnózy z tkání FFPE již desítky let a jsou s nimi velmi dobře obeznámeni. Tkáň FFPE lze také použít pro některé studie IHC. Tkáň FFPE nemusí být vhodná pro analýzu nativních proteinů a obecně je horší pro typy genetické analýzy, jako je PCR, qPCR nebo sekvenování DNA nové generace, které se stávají běžnými. Naproti tomu zmrazená tkáň zachovává DNA, RNA a nativní proteiny. Archivy zmrazené tkáně se však mohou rychle ztratit v důsledku výpadku proudu, mechanické poruchy nebo neopatrnosti v laboratoři. Zmrazené tkáně jsou také méně známé patologům, kteří obecně pohodlněji stanovují diagnózy po mikroskopické analýze tkáně FFPE.