FPE vs tkanka mrożona zostanie przeanalizowana w tym artykule. Badania medyczne nad nowotworami i innymi chorobami wymagają dostępu do unikalnych narzędzi i materiałów – w tym próbek do badań. Na przykład, jeśli badamy kształt i strukturę komórek (morfologię), stany chorobowe, komunikację wewnątrz- i międzykomórkową lub pokrewne tematy, niezwykle przydatny jest dostęp do wiarygodnych wycinków tkanek poddanych biopsji. Ponieważ większość materiałów biologicznych jest delikatna i łatwo się psuje, należy zadbać o ich odpowiednie przygotowanie i konserwację. Istnieją dwie główne metody przygotowywania tkanek stosowane obecnie. Przez dziesięciolecia tkanki były nasączane formaliną (alias formaldehydem), a następnie zatapiane w bloku parafiny (określane jako utrwalone formaliną tkanki parafinowe lub FFPE). Wraz z pojawieniem się niezawodnych zamrażarek ultraniskotemperaturowych i obfitych dostaw ciekłego azotu, możliwe stało się zamrażanie tkanki jako drugi sposób długoterminowego przechowywania. Każda z tych dwóch metod ma swoje wady i zalety. Poniżej przedstawiono porównanie mocnych i słabych stron tych dwóch metod konserwacji.
tkankiFFPE
Tkanki utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie są najczęstszym źródłem archiwizowanego materiału. Patolodzy szpitalni tworzą i archiwizują tkanki FFPE od dziesięcioleci. Za każdym razem, gdy badają biopsję pobraną od pacjenta, archiwizują część tego materiału do późniejszego wykorzystania – czasami odwołując się do niego lub uzyskując drugą opinię w trakcie leczenia pacjenta. Naukowcy konserwują również tkanki pobrane od ludzi lub od zwierząt, aby stworzyć archiwa materiałów do późniejszych badań. Archiwa te nazywane są „biobankami” i mogą być tworzone przez uniwersytety i szpitale lub tworzone w celach komercyjnych przez firmy obsługujące środowisko naukowe. Działania te doprowadziły do udostępnienia ogromnych zbiorów materiałów do późniejszych badań. Ponieważ archiwa te były tworzone przez bardzo długi czas, mogą one oferować perspektywę historyczną, jak również być po prostu obfitym źródłem materiału badawczego. Ponieważ tkanki FFPE mogą być przechowywane w szafie w temperaturze pokojowej, można tanio stworzyć dużą kolekcję, która będzie stabilna przez bardzo długi czas. Formalina i wosk zachowują delikatne struktury wewnątrz i pomiędzy komórkami w tkance – co sprawia, że tkanka FFPE jest doskonałym materiałem dla osób badających morfologię komórek i tkanek – takich jak patolodzy, którzy badają zachowane biopsje w celu zdiagnozowania raka. W tkance FFPE zachowane są również białka, a nie tylko struktury widoczne pod mikroskopem. Histolodzy mogą używać przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie (lub przeciwciał znakowanych w inny sposób), które wiążą się specyficznie z określonymi białkami, aby sprawdzić, czy są one obecne w określonych komórkach tkanek oraz czy lokalizacja i ilość tych białek różni się w chorych i zdrowych tkankach. Metoda ta jest określana jako immunohistochemia (IHC). Wreszcie, ponieważ FFPE jest starą i dobrze ugruntowaną metodą przechowywania tkanek, patolodzy są przyzwyczajeni do badania i stawiania diagnoz na podstawie biopsji tkanek FFPE. Jeśli chcesz dowiedzieć się więcej, przeczytaj nasz wpis na blogu, czym jest tkanka FFPE i jakie są jej zastosowania.
Wady tkanki FFPE
Formalina jest lotna, toksyczna i okropnie pachnie. Większość procedur embedowania i utrwalania parafiny jest również pracochłonna i czasochłonna. Dodatkowo, podczas gdy białka są konserwowane, są one również denaturowane. Nie są już biologicznie aktywne. Mogą również nie wiązać się z tymi samymi przeciwciałami, co niedenaturowane (lub natywne) wersje tych samych białek. Może to w pewien sposób ograniczyć ich wartość dla niektórych rodzajów badań IHC i uczynić je bezużytecznymi dla analiz biochemicznych. Innym problemem jest to, że kwasy nukleinowe (DNA i RNA) w tkance FFPE nie są zbyt dobrze zachowane. Chociaż kwasy nukleinowe mogą być izolowane z tego typu zakonserwowanej tkanki, ich użyteczność może być ograniczona. Dlatego tkanka FFPE nie zawsze może być odpowiednia do molekularnej analizy genetycznej. Wreszcie, większość protokołów FFPE nie jest standaryzowana. Oznacza to, że nie ma gwarancji, że próbki pobrane w różnym czasie lub miejscu były przygotowywane w podobny sposób. Niestandaryzowane metody preparatyki mogą mieć nieproporcjonalnie duży wpływ na uzyskane wyniki – szczególnie w przypadku molekularnej analizy genetycznej. Niektóre analizy molekularne można wykonać, ale wiele się traci, gdy tkanka jest konserwowana metodą FFPE.
Zamrożone tkanki
Z drugiej strony, zamrożone tkanki bardzo dobrze nadają się do molekularnej analizy genetycznej – zwłaszcza jeśli materiały biopsyjne są zanurzane w ciekłym azocie w metodzie zwanej „flash freezing,” a następnie przechowywane w ultra zimnej zamrażarce w temperaturze poniżej -80 stopni Celsjusza. Jeśli więc dysponujesz zamrażarką „-80” i ciekłym azotem, świeże, zamrożone tkanki są łatwe do przygotowania. Zamrożone próbki macierzy tkankowej są również bardzo przydatne do analizy IHC, ponieważ białka są zachowane w stanie natywnym. Te „natywne”, niedenaturowane białka mogą być również izolowane w wciąż aktywnej formie, do analizy biochemicznej. Tkanka ulega jednak szybkiej degradacji w temperaturze pokojowej i nie przechowuje się dobrze, gdy jest przechowywana w bardziej standardowej zamrażarce „-20” lub domowej. Należy ją jak najszybciej zamrozić, a następnie przechowywać w bardzo niskiej temperaturze. W przypadku tkanki z biopsji może to być trudne, ponieważ chirurdzy mogą nie mieć pod ręką ciekłego azotu, aby błyskawicznie zamrozić wycięty materiał nowotworowy. Aby utrzymać zamrożoną tkankę przez cały czas, potrzebna jest również specjalna zamrażarka ultraniskotemperaturowa. Archiwa z zamrożonymi tkankami są zawsze narażone na przerwy w dostawie prądu lub awarie mechaniczne. Nieuważni technicy mogą również pozostawić cenne próbki na swoich stołach laboratoryjnych lub zapomnieć o zamknięciu drzwi zamrażarki. Wreszcie, jako nowsza metoda, biobanki generalnie mają mniejsze kolekcje tkanek mrożonych.
Podsumowanie FFPE VS Tkanka mrożona
Podsumowując, tkanki FFPE dobrze nadają się do tworzenia dużych archiwów tkanek do badań. Raz przygotowana tkanka FFPE jest bardzo odporna. Nie wymaga specjalnego sprzętu, aby utrzymać ją stabilną przez dziesięciolecia. Patolodzy stawiają diagnozy z tkanek FFPE od dziesięcioleci i są z nimi bardzo zaznajomieni. Tkanka FFPE może być również używana do niektórych badań IHC. Tkanka FFPE może nie być odpowiednia do analizy białek natywnych i generalnie jest gorsza do typów analizy genetycznej, takich jak PCR, qPCR lub sekwencjonowanie DNA nowej generacji, które stają się powszechne. Z drugiej strony, tkanka zamrożona zachowuje DNA, RNA i natywne białka. Jednak archiwa mrożonych tkanek mogą być szybko utracone z powodu przerw w dostawie prądu, awarii mechanicznych lub nieostrożności w laboratorium. Tkanki mrożone są również mniej znane patologom, którzy generalnie czują się bardziej komfortowo stawiając diagnozy po analizie mikroskopowej tkanki FFPE.