ChIP je výkonná technika používaná ke studiu asociace specifických proteinů nebo jejich modifikovaných izoforem s definovanými oblastmi genomu. Jedná se o rychle se rozvíjející výzkumnou techniku, která se běžně používá k mapování interakcí mezi DNA a proteiny v buňkách, které jsou klíčové pro správnou regulaci genů. Lze je například použít ke zjištění, zda se proteiny, jako jsou transkripční faktory a modifikované histony, vážou na určitou oblast DNA živých buněk nebo tkání.
Mapování interakcí proteinů s DNA v celém genomu je nezbytné pro úplné pochopení genové regulace. Podrobná mapa epigenetických značek a vazeb transkripčních faktorů je nezbytná pro odvození regulačních sítí, které jsou základem genové exprese v různých biologických systémech. Nejpoužívanějším nástrojem pro zkoumání těchto interakcí je ChIP s následným masivně paralelním sekvenováním (ChIP-seq)
Jak ChIP-seq funguje?
ChIP-seq začíná tradičním testem ChIP, který zahrnuje fixaci buněk (cross-linking), střih chromatinu, imunoprecipitaci (IP), reverzní crosslinking a purifikaci DNA. Živé buňky se fixují reverzibilním síťovacím činidlem, aby se zachovaly interakce protein-DNA v jejich přirozených místech, a poté se lyzují, aby se uvolnil chromatin pro střih. Po zesíťování se chromatin sestříhá na určitý rozsah velikostí (100-500 bp) pro optimální výsledky IP a ChIP-seq. K dosažení velikosti fragmentů v rozmezí 100-500 bp lze použít buď sonikaci, nebo enzymatické stříhání, chromatin se poté imunoprecipituje pomocí zájmové protilátky a izoluje.
ChIP vytvoří knihovnu cílových míst DNA, která byla v přímém fyzickém kontaktu s regulačními mechanismy in vivo. K fragmentům DNA, které byly navázány na zájmový protein, se poté přidají oligonukleotidové adaptéry, které umožní masivně paralelní sekvenování. Po selekci velikosti se všechny výsledné fragmenty ChIP DNA sekvenují současně, čímž se s vysokým rozlišením vyhledávají asociace v celém genomu. Mapování sekvenovaných fragmentů do databází sekvencí celého genomu umožňuje rychle a efektivně analyzovat vzorec interakcí DNA jakéhokoli TF nebo epigenetické modifikace.
ChIP-seq byl umožněn díky technologickému pokroku, který nám umožňuje mapovat celé genomy a přesně určit vazebná místa proteinů kombinací ChIP testu s platformami sekvenování nové generace. Určení konkrétní sekvence genu, na kterou se protein váže, pomocí ChIP-seq pomáhá výzkumníkům v oblasti epigenetiky pokročit ve studiích interakcí proteinů s DNA a získat cenné poznatky o vývoji onemocnění.