Caracteristicile stării excitate a DAPI liber și a DAPI legat de ADN
Viața stării excitate a DAPI este bine cunoscută26, așa că am măsurat durata de viață a DAPI nelegat în soluție PBS (pH 7.2) pentru a determina atât sensibilitatea sistemului, cât și precizia măsurătorilor duratei de viață. Declinul fluorescenței a prezentat un caracter dublu exponențial: componentele duratei de viață a fluorescenței, τ și coeficienții de intensitate, a, sunt raportate în tabelul 1. Valoarea componentei lungi a duratei de viață este în concordanță cu cea din literatura de specialitate, în timp ce valoarea componentei scurte a duratei de viață este mai mare decât cea descrisă în literatura de specialitate la pH 7, unde intervalul de valori este de 0,19-0,24 ns26.
Am măsurat apoi duratele de viață ale DAPI legat de ADN care conține diferite cantități de baze AT și GC pentru a determina dacă compoziția bazei ADN are vreun efect asupra duratei de viață a DAPI. Pentru această parte a studiului au fost utilizate ADN de timus de vițel (CT) și ADN de micrococcus luteus (ML), datorită compoziției diferite a perechilor de baze (42% GC pentru ADN CT și 72% GC pentru ADN ML). Au fost măsurate câte trei soluții de ADN CT și ML. Durata de viață a DAPI pentru fiecare tip de ADN a prezentat două componente (tabelul 1). Componenta scurtă a duratei de viață a DAPI legat de ADN ML este ușor mai mare decât cea a ADN CT (diferență de 130 ps). Nu se observă nicio diferență semnificativă între componentele cu durată de viață lungă.
FLIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromosomes from B-Lymphocytes
Figura 1a prezintă o imagine a duratei de viață a unei „răspândiri” tipice a cromozomilor metafazici umani fixați în 3:1 metanol:acid acetic (a se vedea Methods for the definition of chromosome spread). O imagine extinsă a regiunii incluse în figură, realizată la o rezoluție mai mare a pixelilor, este prezentată în Fig. 1b. Culoarea falsă este utilizată pentru a reprezenta valoarea duratei de viață la fiecare pixel al imaginii.
Variații ale duratei de viață a DAPI de-a lungul lungimii cromozomilor.
Imagini ale duratei de viață a (a) unui cromozom întins (bară de scară = 10 μm) și (b) o imagine extinsă a regiunii închise din Fig. 1a luată la o rezoluție mai mare a pixelilor, care arată cromozomii 1 și 9 (bară de scară = 2 μm). Figura 1b inset: curbe de scădere a fluorescenței DAPI normalizate la pixeli selectați din regiunile roșie, verde și albastră din cromozomul 9 din Fig. 1b. Intervalul scalei de culoare a duratei de viață variază de la 2,50 ns (roșu) la 3,14 ns (albastru), după cum se arată.
Ambele figuri arată că există o variație a duratei de viață a DAPI de-a lungul lungimii cromozomilor. Curbele de descreștere a fluorescenței DAPI cu intensități normalizate sunt, de asemenea, prezentate în Fig. 1b pentru a completa imaginile privind durata de viață și arată că fluorescența moleculelor DAPI din regiunile roșii are o descreștere mai rapidă decât cea din regiunile albastre. Durata medie de viață ± deviația standard (SD) a DAPI pentru răspândirea cromozomială măsurată în Fig. 1a a fost determinată ca fiind de 2,91 ± 0,12 ns; s-a constatat că descreșterea fluorescenței DAPI are o caracteristică exponențială unică.
Identificarea regiunilor heteromorfe în cromozomi
Douăsprezece răspândiri cromozomiale (celule GM18507) cu 46 de cromozomi fiecare au fost măsurate din trei lame. Figura 2a prezintă o imagine de durată de viață a uneia dintre răspândirile măsurate. În fiecare dintre eșantioanele măsurate, am constatat că anumiți cromozomi au regiuni specifice de-a lungul lungimii lor care au durate de viață semnificativ mai scurte decât restul cromozomului, mai ales în imediata apropiere a centromerilor. Aceste regiuni apar roșii în imaginile de durată de viață din cauza scalei de culori utilizate; ne vom referi la ele ca fiind regiuni cu durată de viață scurtă.
Identificarea regiunilor heteromorfe în cromozomi.
(a) Imagine de durată de viață a unui cromozom întins cu săgeți care arată regiunile heteromorfe (bara de scară = 10 μm). (b) Curbe normalizate de distribuție a duratei de viață pentru regiunile heteromorfe și pentru restul cromozomilor, care arată durate de viață DAPI mai scurte pentru regiunile heteromorfe decât pentru restul cromozomilor. (c) Imagine mFISH a răspândirii cromozomiale măsurate. (d) Cariotiparea cromozomilor din Fig. 2a,c pe baza culorii.
Curbele de distribuție a duratei de viață cu frecvențe normalizate pentru regiunile cu durată de viață scurtă și pentru restul cromozomilor din Fig. 2a sunt prezentate în Fig. 2b. Durata medie de viață ± SD a moleculelor de DAPI din regiunile cu durată de viață scurtă din Fig. 2a a fost determinată ca fiind de 2,48 ± 0,13 ns, în timp ce cea pentru moleculele din restul cromozomilor din distribuție a fost determinată ca fiind de 2,80 ± 0,09 ns. Abaterile standard reprezintă cât de variate sunt valorile duratei de viață în cadrul regiunilor cu durată de viață scurtă și în restul cromozomilor pentru răspândirea măsurată.
Am bănuit că regiunile cu durată de viață scurtă corespund unor regiuni heteromorfe din cromozomi. Astfel de regiuni prezintă variații în morfologie în locații specifice, fără a afecta însă fenotipul și sunt adesea de natură heterocromatică. Variațiile morfologice cunoscute ale regiunilor heteromorfe au fost asociate cu longevitatea și infertilitatea și, prin urmare, sunt de mare interes în studiile de genetică. Se știe că regiunile heteromorfe apar pe cromozomii 1, 9, 15, 16 și pe cromozomul Y27.
S-a decis să se efectueze experimente mFISH (a se vedea Metode) pe toate răspândirile măsurate pentru a identifica cromozomii care conțin regiunile cu durată de viață scurtă. Imaginea mFISH și cariotipul răspândirii din Fig. 2a sunt prezentate în Fig. 2c,d, respectiv în Fig. 2c,d. Regiunile care prezintă durate de viață mai scurte, în comparație cu restul cromozomilor, în toate răspândirile măsurate au fost identificate ca fiind regiunile pericentromerice ale cromozomilor 1, 9 și 16, brațul scurt al cromozomului 15 și regiunea distală a cromozomului Y; se știe că aceste regiuni sunt regiuni heteromorfe, ceea ce confirmă ipoteza noastră.
Tabelul 2 prezintă valoarea medie a duratei de viață a DAPI pentru fiecare dintre regiunile heteromorfe din Fig. 2a. Deoarece fiecare autosom apare de două ori, valorile medii ale duratei de viață și abaterile standard pentru regiunile heteromorfe obținute pentru autosomii cu același număr de cromozomi au fost mediate și, respectiv, puse în comun.
Se poate observa din tabel că duratele de viață măsurate pentru regiunile heteromorfe ale cromozomilor 1, 16 și Y sunt similare și sunt semnificativ mai lungi decât cele ale cromozomilor 9 și 15. Regiunea heteromorfă a cromozomului 9 poate fi descrisă prin două durate de viață, astfel încât regiunea 9a are o valoare similară cu cea a cromozomului 15, în timp ce regiunea 9b are o durată de viață mai scurtă decât cea a regiunii 9a.
Celelalte extinderi măsurate (a se vedea tabelele S1-S11 din materialele suplimentare) arată o tendință similară, regiunile heteromorfe ale cromozomilor 9 și 15 având durate de viață mai scurte decât cele ale cromozomilor 1, 16 și Y.
Tendințe ale duratei de viață a DAPI în funcție de suprafața cromozomului
Se știe că cromozomii devin progresiv mai compacți pe măsură ce se apropie de stadiul de metafază al ciclului celular; pentru acest studiu s-a folosit Colcemid pentru a bloca celulele în acest stadiu înainte de recoltare. Cu toate acestea, nu se așteaptă ca toate celulele din populația sincronizată să se afle exact în același stadiu de condensare la recoltare. Această variație a condensării se reflectă în variația suprafeței relative a unui anumit cromozom de la un cromozom răspândit la altul pe aceeași lamă, cromozomii mai compacți având suprafețe mai mici. Am anticipat că diferitele stări de compactare ar putea avea un efect asupra duratei de viață a fluorescenței observate. Pentru a măsura efectul compactării cromatinei asupra duratelor de viață, am corelat duratele medii de viață DAPI pentru diferite exemple de cromozomi 1 (celule GM18507) de pe o lamelă și regiunile heteromorfe ale acestora cu aria măsurată a cromozomului. Așa cum am descris anterior, valorile duratei de viață pentru perechile de cromozomi au fost mediate, pixelilor li s-a atribuit o culoare în funcție de valoarea duratei de viață, iar regiunile cu durată de viață scurtă (regiuni roșii) au fost considerate ca fiind de natură heteromorfă. Segmentarea și analiza regiunilor heteromorfe și calcularea zonelor cromozomiale au fost efectuate cu ajutorul software-ului Avizo.
Graficul din Fig. 3 arată că duratele medii de viață ale DAPI pentru cromozomul 1 și regiunea heteromorfă a acestuia scad puternic odată cu scăderea zonei cromozomului 1. În măsura în care suprafața unui cromozom într-o răspândire reprezintă densitatea de împachetare, tendința observată sugerează o dependență liniară de densitate, reprezentând gradul de condensare. O tendință similară este, de asemenea, observată pentru răspândirea cromozomilor pe o altă lamă (a se vedea figura S1).
Viața medie de fluorescență a DAPI pentru diferiți cromozomi 1 și regiunile heteromorfe ale acestora, reprezentată grafic în funcție de suprafața cromozomilor.
Barele de eroare reprezintă abaterea standard. Astfel, DAPI este sensibil atât la compactarea generală a lungimii cromozomilor, cât și la condensarea localizată a sub-cromozomilor.
Efectul concentrației de DAPI asupra duratei de viață
Pentru a determina efectul concentrației de DAPI asupra duratei de viață au fost măsurate duratele medii de viață ale DAPI pentru diverși cromozomi 1’s (celule GM18507) colorați cu diferite concentrații de DAPI. Douăsprezece cromozomi 1, cu aproximativ aceeași suprafață, de pe aceeași lamelă, au fost măsurați pentru fiecare concentrație.
Se poate observa din tabelul 3 că intensitatea totală a cromozomului 1 a crescut odată cu creșterea concentrației de DAPI. Cu toate acestea, nu s-a observat nicio variație semnificativă a duratei de viață a DAPI între diferitele concentrații.
FLIM of Hoechst 33258 Bound to Fixed Metaphase Chromosomes
Pentru a confirma faptul că variațiile duratei de viață pe care le-am observat de-a lungul lungimii cromozomilor sunt o funcție a structurii cromatinei și nu se datorează unor efecte specifice DAPI, am efectuat FLIM folosind un alt colorant de legare a canelurilor minore. Cromozomii în metafază (celule GM18507) fixați în 3:1 metanol:acid acetic au fost colorați cu Hoechst 33258.
Figura 4 prezintă imaginea de durată de viață a răspândirii cromozomului măsurată. S-a constatat că descreșterea fluorescenței lui Hoechst 33258 legat de cromozomi are caracteristici exponențiale simple, similare cu cea a DAPI. Durata medie de viață ± SD a Hoechst 33258 pentru răspândirea măsurată a fost determinată ca fiind de 2,42 ± 0,05 ns. Abaterea standard mai mică, în comparație cu cea a cromozomilor colorați cu DAPI (0,12 ns), arată că variația duratei de viață a lui Hoechst 33258 de-a lungul intervalului nu este la fel de mare ca cea observată pentru cromozomii colorați cu DAPI. Imaginea duratei de viață arată că regiunile heteromorfe ale cromozomilor 1, 9, 15, 16 și Y au prezentat valori ale duratei de viață semnificativ mai scurte decât restul cromozomilor (a se vedea figura S2 pentru imaginea mFISH și cariotip), similar cu cel observat pentru cromozomii colorați cu DAPI. Durata medie de viață ± SD a moleculelor de Hoechst 33258 din regiunile heteromorfe a fost determinată ca fiind de 2,36 ± 0,03 ns, în timp ce cea pentru moleculele din restul cromozomilor din răspândire a fost determinată ca fiind de 2,43 ± 0,04 ns. Valorile medii ale duratei de viață a Hoechst 33258 și abaterile standard pentru fiecare dintre regiunile heteromorfe ale cromozomilor 1, 9, 15, 16 și Y, în comparație cu restul cromozomului, sunt prezentate în tabelul S12.
Imaginea de durată de viață a unui cromozom întins colorat cu Hoechst 33258 cu săgeți care arată regiunile heteromorfe (bara de scară = 10 μm).
Acest experiment suplimentar cu Hoechst confirmă faptul că variațiile de durată de viață observate pe lungimea cromozomilor sunt cauzate de structura locală a cromatinei și nu de fluoroforul utilizat.
FLIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromosomes from HeLa Cells
MăsurătorileFLIM pe cromozomi metafazici colorați cu DAPI obținuți din celule HeLa fixate în 3:1 metanol:acid acetic au fost, de asemenea, efectuate pentru a verifica faptul că variațiile duratei de viață a DAPI observate pe lungimea cromozomilor nu sunt doar specifice liniei celulare, ci sunt datorate structurii generale a cromatinei.
Figura 5a prezintă întinderea măsurată a cromozomilor. Durata medie de viață ± SD a DAPI pentru răspândirea măsurată a fost determinată ca fiind de 2,93 ± 0,09 ns. Duratele de viață mai scurte ale DAPI, în comparație cu restul cromozomilor, sunt observate în regiunile heteromorfe ale cromozomilor 1, 9, 15, 16 și Y (a se vedea figura S3 pentru imaginea mFISH și cariotip), similar cu cel observat pentru celulele GM18507. Patru cromozomi anormali care constau într-o parte fie a cromozomului 1, fie a cromozomului 9 au prezentat, de asemenea, durate de viață DAPI mai scurte în regiunile lor pericentromerice, sugerând că aceștia conțin regiunea heteromorfă a cromozomului 1 sau 9. Curbele de distribuție a duratei de viață cu frecvențe normalizate pentru regiunile cu durată de viață scurtă și pentru restul cromozomilor sunt prezentate în Fig. 5b. Durata medie de viață a moleculelor de DAPI din regiunile cu durată de viață scurtă a fost determinată ca fiind de 2,68 ± 0,08 ns, în timp ce cea a moleculelor din restul cromozomilor din distribuție a fost determinată ca fiind de 2,93 ± 0,08 ns.
Identificarea regiunilor heteromorfe în cromozomii obținuți din celule HeLa.
(a) Imagine de durată de viață a unui cromozom împrăștiat cu săgeți care arată regiunile heteromorfe. Cromozomii înglobați într-un pătrat punctat galben sunt cromozomii anormali (bară de scară = 10 μm). (b) Curbe normalizate de distribuție a duratei de viață pentru regiunile heteromorfe și restul cromozomilor, care arată durate de viață DAPI mai scurte pentru regiunile heteromorfe decât pentru restul cromozomilor.
FLIM of DAPI Bound to Interphase Chromosomes within Fixed Nuclei
S-a imaginat, de asemenea, durata de viață a DAPI legat de cromozomii interfazici într-un nucleu fixat în 3:1 metanol:acid acetic din linia celulară de limfocite GM18507, așa cum se arată în Fig. 6. A fost realizată o fotografie z-stack a nucleului cu ajutorul unui microscop confocal cu excitație multifotonică (la 760 nm). Fig. 6a,c prezintă imagini obținute la -0,50 μm și, respectiv, +0,50 μm, din planul focal original (Fig. 6b).
Plani focali selectați din z-stack-ul imaginilor de durată de viață ale nucleului în interfază din celulele GM18507 la (a) -0,50 μm, (b) 0 μm și (c) +0.focalizare de 50 μm (barele de scară = 5 μm, a se vedea figura S5 pentru toate planurile focale din z-stack).
Un singur caracter exponențial a fost observat pentru descreșterea fluorescenței DAPI. Imaginile cu durata de viață a nucleului măsurat arată că există o variație puternică a duratei de viață a DAPI de-a lungul nucleului interfazat, unde pot fi observate regiuni localizate cu durate de viață scurte (indicate prin săgeți în Fig. 6). Chiar dacă nucleul fixat este oarecum prăbușit în comparație cu forma sa sferică nativă, ca urmare a procesului de fixare, aceasta arată locațiile regiunilor cu durată de viață scurtă în trei dimensiuni. Reconstrucția 3D a imaginilor confocale z-stack (a se vedea figura S4) și analiza cantitativă a regiunilor cu durată de viață scurtă au fost efectuate cu ajutorul software-ului Avizo.
Tabelul 4 prezintă volumul, durata medie de viață și poziția în raport cu raza nucleului a regiunilor cu durată de viață scurtă. Volumele calculate pentru regiunile cu durată de viață scurtă se dovedesc a fi mai mari decât volumul tipic al unui cromozom în metafază (~1-3 um3), sugerând o decompactare considerabilă a cromatinei în interfază. Pozițiile regiunilor cu durată de viață scurtă au fost calculate pentru a determina dacă acestea au locații preferențiale în nucleu. Se poate observa din tabel că regiunile cu durată de viață scurtă sunt situate mai aproape de periferie decât de centrul nucleului. Am examinat trei nuclee în acest studiu și am constatat că toate au prezentat o distribuție similară a regiunilor cu durată de viață scurtă (a se vedea figurile S6 și S7 pentru celelalte două nuclee).
Cromozomii interfazici colorați cu DAPI din cadrul unui nucleu din celule fibroblaste pulmonare CCD37LU fixate în 3:1 metanol:acid acetic au fost, de asemenea, măsurați, așa cum se arată în Fig. 7a. Imaginea arată prezența unor regiuni cu durată de viață scurtă în interiorul nucleului, similară cu cea observată în celulele limfocitelor GM18507. Cu toate acestea, regiunile cu durată de viață scurtă nu au o localizare preferențială în interiorul nucleului. Figura 7b prezintă imaginea FISH a nucleului măsurat. Sonda centromerului cromozomului 9 este reprezentată cu roșu în imagine. Comparând figurile 7a,b, se poate observa că locația sondei centromerice a cromozomului 9 se suprapune cu cea a două dintre regiunile cu durată de viață scurtă. Un alt nucleu măsurat arată un rezultat similar și este prezentat în figura S8.
FLIM a nucleului în interfază din celulele CCD37LU.
(a) Imagine a nucleului pe durata de viață. Regiunile cu durată de viață scurtă incluse într-un pătrat roșu punctat au fost identificate ca făcând parte din cromozomul 9 (bară de scară = 5 μm). (b) Imagine FISH a nucleului măsurat care arată localizarea sondei de centromer pentru cromozomul 9 (bară de scară = 5 μm). Locația sondei se suprapune cu cea a regiunilor de scurtă durată de viață închise în Fig. 7a.
.