Excited State Characteristics of Free DAPI and DAPI Bound to DNA
Czas życia stanu wzbudzonego DAPI jest dobrze znany26, więc zmierzyliśmy czas życia niezwiązanego DAPI w roztworze PBS (pH 7.2), aby określić zarówno czułość systemu, jak i dokładność pomiarów czasu życia. Zanik fluorescencji wykazywał charakter podwójnie wykładniczy: składowe czasu życia fluorescencji, τ i współczynniki intensywności, a, są podane w tabeli 1. Wartość składowej długiego czasu życia jest zgodna z literaturą, natomiast wartość składowej krótkiego czasu życia jest wyższa niż opisywana w literaturze przy pH 7, gdzie zakres wartości wynosi 0,19-0,24 ns26.
Następnie zmierzyliśmy czasy życia DAPI związanego z DNA zawierającym różne ilości zasad AT i GC, aby określić, czy skład zasadowy DNA ma jakikolwiek wpływ na czas życia DAPI. Do tej części badań użyto DNA grasicy cielęcej (CT) i DNA mikrokoksu luteus (ML) ze względu na ich różny skład par zasad (42% GC dla CT DNA i 72% GC dla ML DNA). Zmierzono po trzy roztwory CT i ML DNA. Czasy życia DAPI dla każdego rodzaju DNA wykazywały dwie składowe (Tabela 1). Krótka składowa czasu życia DAPI związanego z ML DNA jest nieco wyższa niż w przypadku CT DNA (różnica 130 ps). Nie zaobserwowano znaczącej różnicy pomiędzy składowymi o długim czasie życia.
FLIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromosomes from B-Lymphocytes
Figura 1a przedstawia obraz czasu życia typowego „rozrzutu” ludzkich chromosomów metafazowych utrwalonych w 3:1 metanolu:kwasie octowym (patrz Metody dla definicji rozrzutu chromosomów). Rozszerzony obraz zamkniętego regionu na rysunku, wykonany przy wyższej rozdzielczości pikseli, jest pokazany na Rys. 1b. Kolor fałszywy jest używany do reprezentowania wartości czasu życia w każdym pikselu obrazu.
Zmiany w czasie życia DAPI wzdłuż długości chromosomów.
Obrazy czasu życia (a) rozłożonego chromosomu (pasek skali = 10 μm) i (b) rozszerzony obraz zamkniętego regionu na Rys. 1a wykonany przy wyższej rozdzielczości pikseli pokazujący chromosomy 1 i 9 (pasek skali = 2 μm). Rys. 1b wstawka: znormalizowane krzywe zaniku fluorescencji DAPI w wybranych pikselach z czerwonego, zielonego i niebieskiego regionu w chromosomie 9 na Rys. 1b. Zakres skali kolorów czasu życia wynosi od 2,50 ns (czerwony) do 3,14 ns (niebieski), jak pokazano.
Oba rysunki pokazują, że istnieje zróżnicowanie w czasie życia DAPI wzdłuż długości chromosomów. Krzywe zaniku fluorescencji DAPI z normalizacją intensywności są również przedstawione na Rys. 1b jako uzupełnienie obrazów czasu życia i pokazują, że fluorescencja cząsteczek DAPI w regionach czerwonych ma szybszy zanik niż w regionach niebieskich. Średni czas życia ± odchylenie standardowe (SD) DAPI dla zmierzonego rozprzestrzeniania się chromosomów na Rys. 1a został określony na 2.91 ± 0.12 ns; stwierdzono, że zanik fluorescencji DAPI ma charakterystykę pojedynczego wykładnika.
Identyfikacja heteromorficznych regionów w chromosomach
Dwanaście rozprzestrzeniania się chromosomów (komórki GM18507) z 46 chromosomami każdy zostało zmierzonych z trzech slajdów. Rysunek 2a przedstawia obraz żywotności jednego z mierzonych rozsiania. W każdym z mierzonych rozproszeń stwierdziliśmy, że niektóre chromosomy mają specyficzne regiony wzdłuż ich długości, które mają znacznie krótszy czas życia niż reszta chromosomu, głównie w pobliżu centromerów. Regiony te pojawiają się na obrazach czasu życia na czerwono ze względu na zastosowaną skalę kolorów; będziemy je nazywać regionami o krótkim czasie życia.
Identyfikacja heteromorficznych regionów w chromosomach.
(a) Obraz czasu życia chromosomu z zaznaczonymi strzałkami pokazującymi heteromorficzne regiony (pasek skali = 10 μm). (b) Znormalizowane krzywe rozkładu czasu życia dla regionów heteromorficznych i reszty chromosomów pokazujące krótszy czas życia DAPI dla regionów heteromorficznych niż dla reszty chromosomów. (c) Obraz mFISH zmierzonego rozrzutu chromosomów. (d) Kariotypowanie chromosomów z Rys. 2a,c na podstawie koloru.
Krzywe rozkładu czasów życia ze znormalizowanymi częstościami dla regionów o krótkim czasie życia i reszty chromosomów z Rys. 2a są pokazane na Rys. 2b. Średni czas życia ± SD cząsteczek DAPI w regionach o krótkim czasie życia na Rys. 2a został określony jako 2.48 ± 0.13 ns, podczas gdy dla cząsteczek w reszcie chromosomów w rozrzucie został określony jako 2.80 ± 0.09 ns. Odchylenia standardowe reprezentują jak bardzo zróżnicowane są wartości czasu życia w regionach o krótkim czasie życia i w reszcie chromosomów dla zmierzonego rozrzutu.
Podejrzewaliśmy, że regiony o krótkim czasie życia odpowiadają heteromorficznym regionom w chromosomach. Takie regiony wykazują różnice w morfologii w określonych miejscach, nie wpływając jednocześnie na fenotyp i często są heterochromatyczne w naturze. Znane morfologiczne odmiany regionów heteromorficznych są związane z długowiecznością i niepłodnością, dlatego są bardzo interesujące w badaniach genetycznych. Wiadomo, że regiony heteromorficzne występują na chromosomach 1, 9, 15, 16 i chromosomie Y27.
Postanowiono wykonać eksperymenty mFISH (patrz Metody) na wszystkich zmierzonych rozrzutach w celu zidentyfikowania chromosomów zawierających regiony o krótkim czasie życia. Obraz mFISH i kariotyp rozrzutu z Rys. 2a pokazane są odpowiednio na Rys. 2c,d. Regiony wykazujące krótszy czas życia, w porównaniu z resztą chromosomów, we wszystkich zmierzonych rozrzutach zostały zidentyfikowane jako pericentromeryczne regiony chromosomów 1, 9 i 16, krótkie ramię chromosomu 15 i dystalny region chromosomu Y; te regiony są znane jako regiony heteromorficzne, potwierdzając naszą hipotezę.
Tabela 2 pokazuje średnią wartość czasu życia DAPI dla każdego z heteromorficznych regionów na Fig. 2a. Ponieważ każdy autosom pojawia się dwukrotnie, średnie czasy życia i odchylenia standardowe dla regionów heteromorficznych uzyskane dla autosomów o tym samym numerze chromosomu zostały odpowiednio uśrednione i połączone.
Z tabeli można zauważyć, że zmierzone czasy życia dla regionów heteromorficznych chromosomów 1, 16 i Y są podobne i są znacznie dłuższe niż dla chromosomów 9 i 15. Region heteromorficzny chromosomu 9 może być opisany dwoma czasami życia, tak że region 9a ma podobną wartość do regionu chromosomu 15, podczas gdy region 9b ma krótszy czas życia niż region 9a.
Inne zmierzone rozrzuty (patrz tabele S1-S11 w Materiałach Uzupełniających) wykazują podobną tendencję, że regiony heteromorficzne chromosomów 9 i 15 mają krótsze czasy życia niż regiony chromosomów 1, 16 i Y.
Trends in DAPI Lifetime with Chromosome Area
Chromosomy są znane z tego, że stają się stopniowo bardziej zwarte, gdy zbliżają się do etapu metafazy cyklu komórkowego; Colcemid został użyty do tego badania w celu zablokowania komórek na tym etapie przed zbieraniem. Jednakże, nie oczekuje się, że wszystkie komórki w zsynchronizowanej populacji będą dokładnie w tym samym stadium kondensacji podczas zbioru. To zróżnicowanie w zagęszczeniu jest odzwierciedlone w zróżnicowaniu względnego obszaru danego chromosomu od jednego chromosomu rozprzestrzenionego do drugiego na tym samym szkiełku, przy czym bardziej zwarte chromosomy mają mniejsze obszary. Przewidywaliśmy, że różne stany zagęszczenia mogą mieć wpływ na obserwowane czasy życia fluorescencji. Aby zmierzyć wpływ zagęszczenia chromatyny na czasy życia, skorelowaliśmy średnie czasy życia DAPI dla różnych przykładów chromosomów 1 (komórki GM18507) z jednego szkiełka i ich heteromorficznych regionów z mierzoną powierzchnią chromosomów. Jak opisano wcześniej, wartości czasu życia dla par chromosomów zostały uśrednione, pikselom przypisano kolor zgodnie z wartością czasu życia, a regiony o krótkim czasie życia (regiony czerwone) zostały uznane za heteromorficzne. Segmentację i analizę regionów heteromorficznych oraz obliczanie obszarów chromosomów przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Avizo.
Wykres na ryc. 3 pokazuje, że średnie czasy życia DAPI dla chromosomu 1 i jego regionu heteromorficznego silnie maleją wraz z malejącym obszarem chromosomu 1. W stopniu, w jakim powierzchnia chromosomu w rozprzestrzenianiu reprezentuje gęstość upakowania, obserwowany trend sugeruje liniową zależność od gęstości, reprezentującą stopień kondensacji. Podobną tendencję obserwuje się również dla chromosomów rozsianych na innym szkiełku (patrz Rysunek S1).
Średni czas życia fluorescencji DAPI dla różnych chromosomów 1 i ich heteromorficznych regionów wykreślony względem obszaru chromosomów.
Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Tak więc, DAPI jest wrażliwy zarówno na ogólne zagęszczanie długości chromosomów, jak i zlokalizowaną kondensację podchromosomów.
Effect of DAPI Concentration on Lifetime
Średnie czasy życia DAPI dla różnych chromosomów 1’s (komórki GM18507) barwionych różnymi stężeniami DAPI były mierzone w celu określenia wpływu stężenia DAPI na czas życia. Dwanaście chromosomów 1, w przybliżeniu o tej samej powierzchni, z tego samego szkiełka było mierzonych dla każdego stężenia.
Z tabeli 3 można zaobserwować, że całkowita intensywność chromosomu 1 wzrastała wraz ze wzrostem stężenia DAPI. Nie zaobserwowano jednak istotnej różnicy w czasie życia DAPI pomiędzy różnymi stężeniami.
FLIM of Hoechst 33258 Bound to Fixed Metaphase Chromosomes
W celu potwierdzenia, że obserwowane przez nas zmiany czasu życia wzdłuż długości chromosomów są funkcją struktury chromatyny, a nie wynikają z jakichkolwiek efektów specyficznych dla DAPI, przeprowadziliśmy FLIM z użyciem innego barwnika wiążącego minor-groove. Chromosomy metafazowe (komórki GM18507) utrwalone w 3:1 metanolu:kwasie octowym zostały zabarwione Hoechstem 33258.
Rysunek 4 przedstawia obraz żywotności mierzonego rozprzestrzeniania się chromosomów. Stwierdzono, że zanik fluorescencji Hoechst 33258 związanego z chromosomami ma charakterystykę pojedynczego wykładnika, podobnie jak DAPI. Średni czas życia ± SD Hoechst 33258 dla zmierzonego rozproszenia wynosił 2,42 ± 0,05 ns. Mniejsze odchylenie standardowe, w porównaniu z tym dla chromosomów barwionych DAPI (0,12 ns), wskazuje, że zmienność czasu życia Hoechst 33258 w całym rozsiewie nie jest tak duża jak ta obserwowana dla chromosomów barwionych DAPI. Obraz czasu życia pokazuje, że heteromorficzne regiony chromosomów 1, 9, 15, 16 i Y wykazywały znacznie krótsze wartości czasu życia niż reszta chromosomów (patrz Figura S2 dla obrazu mFISH i kariotypu), podobnie jak w przypadku chromosomów barwionych DAPI. Średni czas życia ± SD cząsteczek Hoechst 33258 w regionach heteromorficznych określono na 2,36 ± 0,03 ns, podczas gdy dla cząsteczek w reszcie chromosomów w rozprzestrzenianiu określono na 2,43 ± 0,04 ns. Średnie wartości czasu życia Hoechst 33258 i odchylenia standardowe dla każdego z heteromorficznych regionów chromosomów 1, 9, 15, 16 i Y, w porównaniu z resztą chromosomu, przedstawiono w tabeli S12.
Ostatni obraz rozprzestrzeniania się chromosomu barwionego Hoechstem 33258 ze strzałkami pokazującymi regiony heteromorficzne (pasek skali = 10 μm).
Ten dodatkowy eksperyment z użyciem Hoechsta potwierdza, że różnice w czasie życia obserwowane na długości chromosomów są spowodowane lokalną strukturą chromatyny, a nie użytym fluoroforem.
FLIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromosomes from HeLa Cells
PomiaryFLIM na chromosomach metafazowych wybarwionych DAPI uzyskanych z komórek HeLa utrwalonych w 3:1 metanolu:kwasie octowym zostały również przeprowadzone w celu zweryfikowania, że różnice w czasie życia DAPI obserwowane wzdłuż długości chromosomów nie są specyficzne dla linii komórkowej, ale wynikają z ogólnej struktury chromatyny.
Rysunek 5a przedstawia zmierzone rozprzestrzenianie się chromosomów. Średni czas życia ± SD DAPI dla zmierzonego rozprzestrzeniania się został określony na 2.93 ± 0.09 ns. Krótszy czas życia DAPI, w porównaniu z resztą chromosomów, obserwuje się w heteromorficznych regionach chromosomów 1, 9, 15, 16 i Y (patrz Rysunek S3 dla obrazu mFISH i kariotypu), podobnie do tego obserwowanego dla komórek GM18507. Cztery nieprawidłowe chromosomy składające się z części chromosomu 1 lub 9 również wykazywały krótsze czasy życia DAPI w ich regionach pericentromerycznych, sugerując, że zawierają one heteromorficzny region chromosomu 1 lub 9. Krzywe rozkładu czasu życia ze znormalizowanymi częstotliwościami dla regionów o krótkim czasie życia i reszty chromosomów są pokazane na Rys. 5b. Średni czas życia cząsteczek DAPI w regionach o krótkim czasie życia został określony na 2,68 ± 0,08 ns, podczas gdy czas życia cząsteczek w pozostałych chromosomach w rozprzestrzenianiu został określony na 2,93 ± 0,08 ns.
Identyfikacja regionów heteromorficznych w chromosomach uzyskanych z komórek HeLa.
(a) Lifetime image of a chromosome spread with arrows showing the heteromorphic regions. Chromosomy zamknięte w żółtym przerywanym kwadracie to chromosomy nieprawidłowe (pasek skali = 10 μm). (b) Znormalizowane krzywe rozkładu czasu życia dla regionów heteromorficznych i reszty chromosomów pokazujące krótszy czas życia DAPI dla regionów heteromorficznych niż dla reszty chromosomów.
FLIM of DAPI Bound to Interphase Chromosomes within Fixed Nuclei
Czas życia DAPI związanego z chromosomami interfazowymi w utrwalonym 3:1 metanolem:kwasem octowym jądrze z linii komórkowej limfocytów GM18507 został również zobrazowany, jak pokazano na Rys. 6. Obraz z-stack jądra został wykonany przy użyciu mikroskopu konfokalnego o wzbudzeniu wielofotonowym (przy 760 nm). Rys. 6a,c przedstawiają obrazy uzyskane odpowiednio w odległości -0,50 μm i +0,50 μm od pierwotnej płaszczyzny ogniskowej (Rys. 6b).
Wybrane płaszczyzny ogniskowe ze stosu z obrazów czasu życia jądra interfazowego z komórek GM18507 przy (a) -0,50 μm, (b) 0 μm i (c) +0.Ognisko 50 μm (paski skali = 5 μm, patrz Figura S5 dla wszystkich płaszczyzn ogniskowych w stosie z).
Pojedynczy wykładniczy charakter zaobserwowano dla zaniku fluorescencji DAPI. Obrazy czasu życia mierzonego jądra pokazują, że istnieje silne zróżnicowanie czasu życia DAPI w całym jądrze interfazowym, gdzie można zaobserwować zlokalizowane regiony o krótkim czasie życia (wskazane strzałkami na Rys. 6). Mimo, że utrwalone jądro jest nieco zapadnięte w porównaniu z jego naturalnym kulistym kształtem w wyniku procesu utrwalania, pokazuje to lokalizacje regionów o krótkim czasie życia w trzech wymiarach. Rekonstrukcja 3D konfokalnych obrazów z-stack (patrz Rysunek S4) i analiza ilościowa regionów o krótkim czasie życia zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Avizo.
Tabela 4 pokazuje objętość, średni czas życia i położenie w odniesieniu do promienia jądra regionów o krótkim czasie życia. Obliczone objętości regionów o krótkim czasie życia okazały się większe niż typowa objętość chromosomu metafazowego (~1-3 um3), co sugeruje znaczną dekompresję chromatyny w interfazie. Pozycje regionów o krótkim czasie życia zostały obliczone w celu określenia, czy mają one preferencyjną lokalizację w jądrze. Z tabeli można zauważyć, że regiony o krótkim czasie życia są zlokalizowane bliżej peryferii niż centrum jądra. W tym badaniu zbadaliśmy trzy jądra i stwierdziliśmy, że wszystkie wykazywały podobny rozkład regionów o krótkim czasie życia (patrz Ryciny S6 i S7 dla pozostałych dwóch jąder).
Zmierzono również chromosomy interfazowe barwione DAPI w obrębie jądra z komórek fibroblastów płucnych CCD37LU utrwalonych w 3:1 metanolu:kwasie octowym, jak pokazano na Ryc. 7a. Obraz pokazuje obecność regionów o krótkim czasie życia w obrębie jądra, podobnych do tych obserwowanych w komórkach limfocytów GM18507. Jednakże, regiony o krótkim czasie życia nie mają preferencyjnej lokalizacji w obrębie jądra. Rysunek 7b przedstawia obraz FISH mierzonego jądra. Sonda centromerowa chromosomu 9 jest zaznaczona na obrazie kolorem czerwonym. Porównując Rys. 7a,b można zauważyć, że lokalizacja sondy centromerowej chromosomu 9 pokrywa się z lokalizacją dwóch regionów o krótkim czasie życia. Inne zmierzone jądro wykazuje podobny wynik i jest przedstawione na Rysunku S8.
FLIM jądra interfazowego z komórek CCD37LU.
(a) Obraz jądra z krótkim czasem życia. Regiony o krótkim czasie życia zamknięte w czerwonym przerywanym kwadracie zostały zidentyfikowane jako część chromosomu 9 (pasek skali = 5 μm). (b) Obraz FISH zmierzonego jądra pokazujący lokalizację sondy centromerowej dla chromosomu 9 (pasek skali = 5 μm). Lokalizacja sondy pokrywa się z lokalizacją zamkniętych regionów o krótkim czasie życia na Rys. 7a.
.