L’uso di imaging di fluorescenza DAPI per indagare la condensazione della cromatina nei cromosomi umani

Caratteristiche dello stato eccitato di DAPI libero e DAPI legato al DNA

La durata dello stato eccitato di DAPI è ben noto26, così abbiamo misurato il tempo di vita di DAPI non legato in soluzione PBS (pH 7.2) per determinare sia la sensibilità del sistema che l’accuratezza delle misure di vita. Il decadimento della fluorescenza ha mostrato un carattere esponenziale doppio: componenti di vita di fluorescenza, τ e coefficienti di intensità, a, sono riportati nella tabella 1. Il valore della componente lunga del tempo di vita concorda bene con la letteratura, mentre il valore della componente breve del tempo di vita è superiore a quello descritto nella letteratura a pH 7 dove l’intervallo di valori è 0,19-0,24 ns26.

Abbiamo poi misurato i tempi di vita di DAPI legato al DNA contenente diverse quantità di basi AT e GC per determinare se la composizione della base del DNA ha qualche effetto sulla vita DAPI. Il DNA di timo di vitello (CT) e il DNA di micrococcus luteus (ML) sono stati utilizzati per questa parte dello studio a causa della loro diversa composizione di coppie di basi (42% GC per il DNA CT e 72% GC per il DNA ML). Sono state misurate tre soluzioni di DNA CT e ML. I tempi di vita del DAPI per ogni tipo di DNA hanno mostrato due componenti (Tabella 1). La componente di vita breve del DAPI legato al DNA ML è leggermente superiore a quella del DNA CT (130 ps di differenza). Non vi è alcuna differenza significativa osservata tra i componenti di lunga durata.

FLIM di DAPI legato a cromosomi fissi metafase da B-Linfociti

Figura 1a mostra un’immagine di vita di un tipico “spread” di cromosomi umani metafase fissati in 3:1 metanolo: acido acetico (vedi metodi per la definizione di diffusione cromosoma). Un’immagine espansa della regione racchiusa nella figura presa ad una risoluzione di pixel più alta è mostrata in Fig. 1b. Falso colore è usato per rappresentare il valore di vita in ogni pixel dell’immagine.

Entrambe le figure mostrano che vi è una variazione nella vita di DAPI lungo la lunghezza dei cromosomi. Le curve di decadimento della fluorescenza DAPI con intensità normalizzate sono anche presentate in Fig. 1b per completare le immagini di durata e mostrano che la fluorescenza delle molecole DAPI nelle regioni rosse ha un decadimento più veloce di quella nelle regioni blu. La vita media ± deviazione standard (SD) di DAPI per la diffusione cromosoma misurato in Fig. 1a è stato determinato per essere 2.91 ± 0.12 ns; il decadimento della fluorescenza di DAPI è stato trovato per avere caratteristica esponenziale singolo.

Identificazione delle regioni eteromorfe in cromosomi

Dodici cromosomi si diffonde (GM18507 cellule) con 46 cromosomi ciascuno sono stati misurati da tre vetrini. La figura 2a mostra un’immagine di vita di uno degli spread misurati. In ciascuno degli spread misurati abbiamo trovato che alcuni cromosomi hanno regioni specifiche lungo la loro lunghezza che hanno una vita significativamente più breve rispetto al resto del cromosoma, soprattutto in prossimità dei centromeri. Queste regioni appaiono rosse nelle immagini di vita a causa della scala di colore utilizzata; ci riferiremo a loro come regioni di vita breve.

Le curve di distribuzione della vita con frequenze normalizzate per le regioni di vita breve e il resto dei cromosomi in Fig. 2a sono mostrati in Fig. 2b. La durata media ± SD delle molecole DAPI nelle regioni a vita breve in Fig. 2a è stato determinato per essere 2,48 ± 0,13 ns mentre quello per le molecole nel resto dei cromosomi nella diffusione è stato determinato per essere 2,80 ± 0,09 ns. Le deviazioni standard rappresentano quanto variano i valori di vita all’interno delle regioni a vita breve e il resto dei cromosomi per lo spread misurato.

Sospettavamo che le regioni a vita breve corrispondessero a regioni eteromorfe nei cromosomi. Tali regioni mostrano variazioni morfologiche in luoghi specifici senza influenzare il fenotipo e sono spesso di natura eterocromatica. Le note variazioni morfologiche delle regioni eteromorfe sono state associate alla longevità e all’infertilità e sono quindi di grande interesse negli studi di genetica. Regioni eteromorfe sono noti per verificarsi sui cromosomi 1, 9, 15, 16 e il cromosoma Y27.

Si è deciso di eseguire esperimenti mFISH (vedi Metodi) su tutti gli spread misurati al fine di identificare i cromosomi contenenti le regioni di vita breve. L’immagine mFISH e il cariotipo della diffusione in Fig. 2a sono mostrati in Fig. 2c,d, rispettivamente. Le regioni che mostrano tempi di vita più brevi, rispetto al resto dei cromosomi, in tutti gli spread misurati sono stati identificati per essere le regioni pericentromeriche dei cromosomi 1, 9 e 16, il braccio corto del cromosoma 15 e la regione distale del cromosoma Y; queste regioni sono note per essere regioni eteromorfe, confermando la nostra ipotesi.

La tabella 2 mostra il valore medio di vita del DAPI per ciascuna delle regioni eteromorfe in Fig. 2a. Poiché ogni autosoma appare due volte, i valori medi di vita e le deviazioni standard per le regioni eteromorfe ottenuti per gli autosomi con lo stesso numero di cromosoma sono stati mediati e messi insieme, rispettivamente.

Si può osservare dalla tabella che i tempi di vita misurati per le regioni eteromorfe dei cromosomi 1, 16 e Y sono simili e sono significativamente più lunghi di quelli dei cromosomi 9 e 15. La regione eteromorfa del cromosoma 9 può essere descritta da due tempi di vita in modo che la regione 9a abbia un valore simile a quello del cromosoma 15 mentre la regione 9b ha un tempo di vita più breve di quello della regione 9a.

Gli altri spread misurati (vedi tabelle S1-S11 nei materiali supplementari) mostrano una tendenza simile delle regioni eteromorfe dei cromosomi 9 e 15 che hanno tempi di vita più brevi di quelli dei cromosomi 1, 16 e Y.

Trends in DAPI Lifetime with Chromosome Area

I cromosomi sono noti per diventare progressivamente più compatti quando si avvicinano alla fase di metafase del ciclo cellulare; Colcemid è stato usato per questo studio per bloccare le cellule in questa fase prima della raccolta. Tuttavia, le cellule della popolazione sincronizzata non dovrebbero essere tutte esattamente nello stesso stadio di condensazione al momento della raccolta. Questa variazione nella compattazione si riflette nella variazione dell’area relativa di un particolare cromosoma da un cromosoma diffuso ad un altro sullo stesso vetrino, con i cromosomi più compatti che hanno aree più piccole. Abbiamo previsto che diversi stati di compattazione potrebbero avere un effetto sulla durata della fluorescenza osservata. Per misurare l’effetto della compattazione della cromatina sui tempi di vita, abbiamo correlato i tempi di vita medi di DAPI per vari esempi di cromosoma 1 (cellule GM18507) da un vetrino e le loro regioni eteromorfe con l’area cromosomica misurata. Come descritto in precedenza, i valori di vita per le coppie di cromosomi sono stati mediati, ai pixel è stato assegnato un colore in base al valore di vita e le regioni a vita breve (regioni rosse) sono state considerate di natura eteromorfa. La segmentazione e l’analisi delle regioni eteromorfe e il calcolo delle aree cromosomiche sono stati eseguiti utilizzando il software Avizo.

Il grafico in Fig. 3 mostra che i tempi di vita medi di DAPI per il cromosoma 1 e la sua regione eteromorfa diminuiscono fortemente con la diminuzione dell’area del cromosoma 1. Nella misura in cui l’area di un cromosoma in uno spread rappresenta la densità di imballaggio, la tendenza osservata suggerisce una dipendenza lineare dalla densità, che rappresenta il grado di condensazione. Una tendenza simile è anche osservata per gli spread dei cromosomi su un altro vetrino (vedi Figura S1).

Effetto della concentrazione di DAPI sulla vita

Le vite medie di DAPI per vari cromosomi 1 (cellule GM18507) colorati con diverse concentrazioni di DAPI sono state misurate per determinare l’effetto della concentrazione di DAPI sulla vita. Dodici cromosomi 1, con approssimativamente la stessa area, dallo stesso vetrino sono stati misurati per ogni concentrazione.

Si può osservare dalla tabella 3 che l’intensità totale del cromosoma 1 aumentava all’aumentare della concentrazione di DAPI. Tuttavia, non è stata osservata alcuna variazione significativa nella durata del DAPI tra le diverse concentrazioni.

FLIM di Hoechst 33258 legato a cromosomi fissi in metafase

Al fine di confermare che le variazioni del tempo di vita che abbiamo osservato lungo la lunghezza dei cromosomi è una funzione della struttura della cromatina e non a causa di eventuali effetti specifici di DAPI, abbiamo effettuato FLIM utilizzando un altro colorante legante minor-groove. Cromosomi metafase (cellule GM18507) fissati in 3:1 metanolo: acido acetico sono stati colorati con Hoechst 33258.

La figura 4 mostra l’immagine di durata della diffusione cromosomica misurata. Il decadimento della fluorescenza di Hoechst 33258 legato ai cromosomi è risultato avere caratteristiche esponenziali singole, simili a quelle del DAPI. La durata media ± SD di Hoechst 33258 per la diffusione misurata è stata determinata in 2,42 ± 0,05 ns. La deviazione standard più piccola, rispetto a quella dei cromosomi colorati con DAPI (0,12 ns), dimostra che la variazione nella vita Hoechst 33258 attraverso la diffusione non è così elevata come quella osservata per i cromosomi colorati con DAPI. L’immagine di durata mostra che le regioni eteromorfe dei cromosomi 1, 9, 15, 16 e Y visualizzato valori di durata significativamente più brevi rispetto al resto dei cromosomi (vedi Figura S2 per l’immagine mFISH e cariotipo), simile a quello osservato per i cromosomi DAPI-colorati. La vita media ± SD di Hoechst 33258 molecole nelle regioni eteromorfe è stato determinato per essere 2.36 ± 0.03 ns mentre quello per le molecole nel resto dei cromosomi nella diffusione è stato determinato per essere 2.43 ± 0.04 ns. I valori medi della durata di Hoechst 33258 e le deviazioni standard per ciascuna delle regioni eteromorfe dei cromosomi 1, 9, 15, 16 e Y, rispetto al resto del cromosoma, sono presentati nella tabella S12.

Questo esperimento aggiuntivo utilizzando Hoechst conferma che le variazioni di durata osservate lungo la lunghezza dei cromosomi sono causate dalla struttura cromatina locale e non il fluoroforo utilizzato.

FLIM di DAPI legato a cromosomi fissi in metafase da cellule HeLa

MisureFLIM su cromosomi in metafase colorati con DAPI ottenuti da cellule HeLa fissate in 3:1 metanolo:acido acetico sono state eseguite anche per verificare che le variazioni nella vita di DAPI osservate lungo la lunghezza dei cromosomi non sono solo specifiche della linea cellulare ma sono dovute alla struttura generale della cromatina.

La figura 5a mostra la diffusione dei cromosomi misurata. La durata media ± SD di DAPI per la diffusione misurata è stato determinato per essere 2,93 ± 0,09 ns. Durata di vita più breve DAPI, rispetto al resto dei cromosomi, sono osservati presso le regioni eteromorfe dei cromosomi 1, 9, 15, 16 e Y (vedi Figura S3 per l’immagine mFISH e cariotipo), simile a quello osservato per le cellule GM18507. Quattro cromosomi anormali che consistono in una parte del cromosoma 1 o 9 hanno anche esibito i tempi di vita DAPI più brevi nelle loro regioni pericentromeriche, suggerendo che contengono la regione eteromorfa del cromosoma 1 o 9. Le curve di distribuzione del tempo di vita con frequenze normalizzate per le regioni di vita breve e il resto dei cromosomi sono mostrati in Fig. 5b. La vita media delle molecole DAPI nelle regioni a vita breve è stata determinata in 2,68 ± 0,08 ns mentre quella per le molecole nel resto dei cromosomi nella diffusione è stata determinata in 2,93 ± 0,08 ns.

FLIM di DAPI legato ai cromosomi interfasici all’interno di nuclei fissi

Il tempo di vita di DAPI legato ai cromosomi interfasici all’interno di un nucleo 3:1 metanolo: acido acetico fisso dalla linea cellulare linfocitaria GM18507 è stato anche imaged, come mostrato in Fig. 6. Un z-stack del nucleo è stato preso utilizzando un microscopio confocale ad eccitazione multifotonica (a 760 nm). Fig. 6a,c mostrano immagini ottenute a -0,50 μm e +0,50 μm, rispettivamente, dal piano focale originale (Fig. 6b).

Un singolo carattere esponenziale è stato osservato per il decadimento della fluorescenza DAPI. Le immagini del tempo di vita del nucleo misurato mostrano che c’è una forte variazione nel tempo di vita del DAPI attraverso il nucleo interfase, dove si possono osservare regioni localizzate di breve tempo di vita (indicate dalle frecce in Fig. 6). Anche se il nucleo fisso è un po ‘collassato rispetto alla sua forma sferica nativa come risultato del processo di fissazione, questo mostra le posizioni delle regioni di vita breve in tre dimensioni. Ricostruzione 3D delle immagini z-stack confocale (vedi Figura S4) e l’analisi quantitativa delle regioni di breve durata sono state effettuate utilizzando il software Avizo.

Tabella 4 mostra il volume, la vita media e la posizione rispetto al raggio del nucleo delle regioni di breve durata. I volumi calcolati per le regioni a vita breve sono risultati più grandi del volume tipico di un cromosoma in metafase (~1-3 um3), suggerendo una notevole decompressione della cromatina in interfase. Le posizioni delle regioni di breve durata sono state calcolate per determinare se hanno posizioni preferenziali nel nucleo. Si può osservare dalla tabella che le regioni a vita breve sono situate più vicino alla periferia che al centro del nucleo. Abbiamo esaminato tre nuclei in questo studio e abbiamo scoperto che tutti hanno mostrato una distribuzione simile delle regioni a vita breve (vedi le figure S6 e S7 per gli altri due nuclei).

Sono stati misurati anche i cromosomi in interfase colorati con DAPI all’interno di un nucleo da cellule di fibroblasti polmonari CCD37LU fissati in 3:1 metanolo:acido acetico, come mostrato in Fig. 7a. L’immagine mostra la presenza di regioni a vita breve all’interno del nucleo, simile a quella osservata nelle cellule linfocitarie GM18507. Tuttavia, le regioni a vita breve non hanno una localizzazione preferenziale all’interno del nucleo. La figura 7b mostra l’immagine FISH del nucleo misurato. La sonda del centromero del cromosoma 9 è mostrata in rosso nell’immagine. Confrontando le Fig. 7a,b, si può osservare che la posizione della sonda centromero del cromosoma 9 si sovrappone a quella delle due regioni a vita breve. Un altro nucleo misurato mostra un risultato simile ed è presentato nella Figura S8.