A szabad DAPI és a DNS-hez kötött DAPI gerjesztett állapotának jellemzői
A DAPI gerjesztett állapotának élettartama jól ismert26, ezért a nem kötött DAPI élettartamát PBS oldatban (pH 7.2), hogy meghatározzuk mind a rendszer érzékenységét, mind az élettartam-mérések pontosságát. A fluoreszcencia bomlása kettős exponenciális jelleget mutatott: a fluoreszcencia élettartam komponenseket, τ és az intenzitási együtthatókat, a, az 1. táblázatban közöljük. A hosszú élettartam-komponens értéke jól egyezik az irodalmi adatokkal, míg a rövid élettartam-komponens értéke magasabb az irodalomban leírtaknál pH 7-nél, ahol az értéktartomány 0,19-0,24 ns26.
A következőkben a különböző mennyiségű AT- és GC-bázist tartalmazó DNS-hez kötött DAPI élettartamát mértük, hogy meghatározzuk, van-e hatása a DNS bázisösszetételének a DAPI élettartamára. A vizsgálatnak ehhez a részéhez borjú tímusz (CT) és micrococcus luteus (ML) DNS-t használtunk, mivel ezek bázispár-összetétele eltérő (42% GC a CT DNS esetében és 72% GC az ML DNS esetében). A CT és az ML DNS egyenként három oldatát mértük meg. A DAPI-életidők mindkét DNS-típus esetében két komponenst mutattak (1. táblázat). Az ML DNS-hez kötött DAPI rövid élettartam-komponense valamivel magasabb, mint a CT DNS-é (130 ps különbség). A hosszú élettartamú komponensek között nem figyelhető meg jelentős különbség.
FLIM of DAPI B-limfociták fixált metafázisú kromoszómáihoz kötött DAPI-ról
Az 1a. ábra a 3:1 metanol:ecetsav arányban fixált emberi metafázisú kromoszómák egy tipikus “elterjedésének” élettartam-képét mutatja (a kromoszóma elterjedésének definícióját lásd a Módszereknél). Az 1b. ábrán az ábrán szereplő zárt régió nagyobb pixelfelbontással készült, kibővített képe látható. Hamis színt használunk az élettartam értékének ábrázolására az egyes képpixeleken.
A DAPI élettartamának változása a kromoszómák hossza mentén.
Lifetime képek (a) egy kromoszóma szétterjedéséről (méretarányos sáv = 10 μm) és (b) az 1a. ábra zárt régiójának nagyobb pixelfelbontással készült kiterjesztett képe, amely az 1. és 9. kromoszómát mutatja (méretarányos sáv = 2 μm). 1b. ábra betét: normalizált DAPI fluoreszcencia-csökkenési görbék az 1b. ábrán a 9. kromoszóma piros, zöld és kék régióiból kiválasztott pixeleken. Az élettartam színskála tartománya az ábrán látható módon 2,50 ns (piros) és 3,14 ns (kék) között mozog.
Mindkét ábrán látható, hogy a DAPI élettartama a kromoszómák hossza mentén változik. Az 1b. ábrán az élettartam-képek kiegészítéseként a DAPI fluoreszcencia lecsengési görbéit is bemutatjuk normalizált intenzitásokkal, amelyek azt mutatják, hogy a DAPI molekulák fluoreszcenciája a piros régiókban gyorsabban lecseng, mint a kék régiókban. A DAPI átlagos élettartamát ± standard eltérés (SD) az 1a. ábrán mért kromoszómaszóródás esetében 2,91 ± 0,12 ns-ban határoztuk meg; a DAPI fluoreszcencia-csökkenése egyszeres exponenciális jellegzetességűnek bizonyult.
Heteromorf régiók azonosítása a kromoszómákban
Tizenkét kromoszómaszóródás (GM18507 sejtek) egyenként 46 kromoszómával három tárgylemezről került mérésre. A 2a. ábra az egyik mért szórás élettartam-képét mutatja. A mért szórások mindegyikében azt találtuk, hogy bizonyos kromoszómák hosszában vannak olyan specifikus régiók, amelyek élettartama jelentősen rövidebb, mint a kromoszóma többi részének, többnyire a centromerek közelében. Ezek a régiók az élettartam-képeken az alkalmazott színskála miatt pirosan jelennek meg; ezekre rövid élettartamú régiókként fogunk hivatkozni.
Heteromorf régiók azonosítása a kromoszómákban.
(a) Egy kromoszóma terjedésének élettartam-képe a heteromorf régiókat mutató nyilakkal (méretsáv = 10 μm). (b) Normalizált élettartam-eloszlási görbék a heteromorf régiókra és a kromoszómák többi részére, amelyek rövidebb DAPI élettartamot mutatnak a heteromorf régiókban, mint a kromoszómák többi részén. (c) A mFISH-kép a mért kromoszómaeloszlásról. (d) A 2a,c ábrán látható kromoszómák kariotipizálása a szín alapján.
A 2b. ábrán a 2a ábrán látható rövid élettartamú régiók és a többi kromoszóma élettartam-eloszlási görbéi a normalizált gyakoriságokkal. A 2a. ábrán a rövid élettartamú régiókban lévő DAPI-molekulák átlagos élettartamát ± SD 2,48 ± 0,13 ns-ban határoztuk meg, míg a kromoszómák többi részén lévő molekulákét a szórásban 2,80 ± 0,09 ns-ban. A standard eltérések azt mutatják, hogy a mért szórásban a rövid élettartamú régiókon és a kromoszómák többi részén belül mennyire eltérőek az élettartamértékek.
Gyanítottuk, hogy a rövid élettartamú régiók a kromoszómák heteromorf régióinak felelnek meg. Az ilyen régiók meghatározott helyeken morfológiai eltéréseket mutatnak, miközben nem befolyásolják a fenotípust, és gyakran heterokromatikus jellegűek. A heteromorf régiók ismert morfológiai variációit összefüggésbe hozták a hosszú élettartammal és a meddőséggel, ezért a genetikai vizsgálatokban nagy érdeklődésre tartanak számot. Heteromorf régiók ismertek az 1., 9., 15., 16. kromoszómán és az Y kromoszómán27.
A rövid élettartamú régiókat tartalmazó kromoszómák azonosítása érdekében mFISH kísérleteket végeztünk (lásd Módszerek) az összes mért szóráson. A 2a. ábrán látható elterjedés mFISH-képét és kariotípusát a 2c,d. ábra mutatja. A többi kromoszómához képest rövidebb élettartamot mutató régiók az összes mért terjedésben az 1., 9. és 16. kromoszóma pericentromerikus régióit, a 15. kromoszóma rövid karját és az Y kromoszóma disztális régióját azonosították; ezek a régiók köztudottan heteromorf régiók, ami megerősíti hipotézisünket.
A 2. táblázat a DAPI átlagos élettartamértékét mutatja a 2a. ábrán látható heteromorf régiók mindegyikére. Mivel minden autoszóma kétszer jelenik meg, az azonos kromoszómaszámú autoszómákra kapott heteromorf régiókra vonatkozó átlagos élettartamokat és standard eltéréseket átlagoltuk, illetve összevontuk.
A táblázatból megfigyelhető, hogy az 1., 16. és Y kromoszómák heteromorf régióinak mért élettartama hasonló, és jelentősen hosszabb, mint a 9. és 15. kromoszómáké. A 9-es kromoszóma heteromorf régiója két élettartammal írható le úgy, hogy a 9a régiónak hasonló értéke van, mint a 15-ös kromoszómának, míg a 9b régiónak rövidebb az élettartama, mint a 9a régióé.
A többi mért szórás (lásd a Kiegészítő anyagok S1-S11 táblázatát) hasonló tendenciát mutat, miszerint a 9-es és 15-ös kromoszómák heteromorf régióinak rövidebb az élettartama, mint az 1, 16 és Y kromoszómáké.
A DAPI élettartamának tendenciái a kromoszóma területével
A kromoszómákról ismert, hogy a sejtciklus metafázis szakaszához közeledve fokozatosan tömörebbé válnak; ebben a vizsgálatban Colcemidet használtunk a sejtek blokkolására ebben a szakaszban a betakarítás előtt. A szinkronizált populációban lévő sejtek azonban várhatóan nem mind pontosan a kondenzáció ugyanazon szakaszában lesznek a betakarításkor. A tömörödésnek ez az eltérése tükröződik egy adott kromoszóma relatív területének eltérésében az ugyanazon a tárgylemezen lévő kromoszómaszórások között, a tömörebb kromoszómák kisebb területűek. Arra számítottunk, hogy a tömörödés különböző állapotai hatással lehetnek a megfigyelt fluoreszcencia-életidőkre. A kromatin tömörödésének az élettartamra gyakorolt hatásának méréséhez korreláltattuk az egy tárgylemezről származó 1. kromoszóma (GM18507 sejtek) különböző példáinak és heteromorf régióinak átlagos DAPI élettartamát a mért kromoszómafelülettel. A korábban leírtak szerint a kromoszómapárok élettartam-értékeit átlagoltuk, a pixelekhez az élettartam-értéknek megfelelő színt rendeltünk, és a rövid élettartamú régiókat (piros régiók) heteromorf jellegűnek tekintettük. A heteromorf régiók szegmentálását és elemzését, valamint a kromoszómaterületek kiszámítását az Avizo szoftver segítségével végeztük el.
A 3. ábrán látható grafikon azt mutatja, hogy a DAPI átlagos élettartama az 1. kromoszómára és annak heteromorf régiójára vonatkozóan erősen csökken az 1. kromoszóma területének csökkenésével. Amennyiben a kromoszóma területe a szórásban a pakolási sűrűséget jelenti, a megfigyelt tendencia a sűrűségtől való lineáris függést sugall, ami a sűrűsödés mértékét jelenti. Hasonló tendencia figyelhető meg a kromoszóma-szóródások esetében is egy másik tárgylemezen (lásd az S1 ábrát).
A DAPI átlagos fluoreszcencia-élettartama különböző 1-es kromoszómák és heteromorf régióik esetében a kromoszómák területének függvényében ábrázolva.
A hibasávok a standard eltérést jelentik. Így a DAPI érzékeny mind az általános kromoszóma hosszbeli tömörülésekre, mind a lokalizált szubkromoszómás tömörülésekre.
A DAPI koncentráció hatása az élettartamra
A DAPI átlagos élettartamát különböző DAPI koncentrációval festett különböző kromoszóma 1′-ek (GM18507 sejtek) esetében mértük, hogy meghatározzuk a DAPI koncentráció hatását az élettartamra. Tizenkét, nagyjából azonos területű, ugyanarról a tárgylemezről származó 1. kromoszómát mértünk minden egyes koncentrációhoz.
A 3. táblázatból megfigyelhető, hogy az 1. kromoszóma teljes intenzitása nőtt a DAPI koncentráció növelésével. A DAPI élettartamában azonban nem volt megfigyelhető jelentős eltérés a különböző koncentrációk között.
Fixált metafázisú kromoszómákhoz kötött Hoechst 33258 FLIM
Azért, hogy megerősítsük, hogy az általunk megfigyelt élettartam-változások a kromoszómák hossza mentén a kromatin szerkezetének függvénye, és nem a DAPI-ra jellemző hatásoknak köszönhető, FLIM-et végeztünk egy másik minor-groove kötőfestékkel. A 3:1 metanol:ecetsav arányban rögzített metafázisú kromoszómákat (GM18507 sejtek) Hoechst 33258-mal festettük.
A 4. ábra a mért kromoszómaszóródás élettartam-képét mutatja. A kromoszómákhoz kötött Hoechst 33258 fluoreszcencia-csökkenése a DAPI-hoz hasonlóan egyszeres exponenciális jellegzetességeket mutatott. A Hoechst 33258 átlagos élettartamát ± SD a mért terjedés esetében 2,42 ± 0,05 ns-ban határozták meg. A DAPI-festett kromoszómákéhoz képest kisebb standard eltérés (0,12 ns) azt mutatja, hogy a Hoechst 33258 élettartamának szóráson belüli szórása nem olyan nagy, mint a DAPI-festett kromoszómák esetében megfigyelt. Az élettartam-kép azt mutatja, hogy az 1., 9., 15., 16. és Y kromoszómák heteromorf régiói lényegesen rövidebb élettartam-értékeket mutattak, mint a kromoszómák többi része (lásd az S2. ábrát az mFISH-kép és a kariotípus tekintetében), hasonlóan a DAPI-festett kromoszómáknál megfigyelthez. A Hoechst 33258 molekulák átlagos élettartamát ± SD a heteromorf régiókban 2,36 ± 0,03 ns-ban határoztuk meg, míg a kromoszómák többi részén a szórásban lévő molekulákét 2,43 ± 0,04 ns-ban. Az 1., 9., 15., 16. és Y kromoszóma heteromorf régióinak átlagos Hoechst 33258 élettartam-értékeit és standard eltéréseit a kromoszóma többi részéhez viszonyítva az S12. táblázat tartalmazza.
Hoechst 33258-mal festett kromoszóma szórt kromoszómájának élettartam képe a heteromorf régiókat mutató nyilakkal (méretarányos sáv = 10 μm).
Ez a Hoechst-tal végzett további kísérlet megerősíti, hogy a kromoszómák hosszában megfigyelt élettartam-változásokat a helyi kromatinszerkezet és nem a használt fluorofór okozza.
LIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromosomes from HeLa Cells
A 3:1 metanol:ecetsav arányban rögzített HeLa sejtekből nyert DAPI-festett metafázis kromoszómákon végzett FLIM méréseket is elvégeztük annak igazolására, hogy a DAPI élettartamában a kromoszómák hossza mentén megfigyelt eltérések nem csak sejtvonal-specifikusak, hanem az általános kromatinszerkezetnek köszönhetőek.
Az 5a. ábra a mért kromoszómaterjedelmet mutatja. A DAPI átlagos élettartamát ± SD a mért terjedésnél 2,93 ± 0,09 ns-nak határoztuk meg. Az 1., 9., 15., 16. és Y kromoszómák heteromorf régióiban (lásd az S3. ábrán az mFISH-képet és a kariotípust) a többi kromoszómához képest rövidebb DAPI élettartam figyelhető meg, hasonlóan a GM18507 sejteknél megfigyelthez. Négy abnormális kromoszóma, amely az 1. vagy a 9. kromoszóma egy részéből áll, szintén rövidebb DAPI élettartamot mutatott a pericentromerikus régióikban, ami arra utal, hogy az 1. vagy a 9. kromoszóma heteromorf régióját tartalmazzák. A rövid élettartamú régiók és a kromoszómák többi részének élettartam-eloszlási görbéit normalizált gyakorisággal az 5b. ábra mutatja. A rövid élettartamú régiókban lévő DAPI-molekulák átlagos élettartamát 2,68 ± 0,08 ns-ban határoztuk meg, míg a kromoszómák többi részén lévő molekulákét 2,93 ± 0,08 ns-ban.
Heteromorf régiók azonosítása HeLa sejtekből nyert kromoszómákban.
(a) Egy kromoszóma szórás élettartam képe a heteromorf régiókat mutató nyilakkal. A sárga szaggatott négyzetbe zárt kromoszómák az abnormális kromoszómák (méretarányos sáv = 10 μm). (b) Normalizált élettartam-eloszlási görbék a heteromorf régiókra és a kromoszómák többi részére, amelyek rövidebb DAPI élettartamot mutatnak a heteromorf régiókban, mint a kromoszómák többi részén.
FLIM of DAPI Bound to Interphase Chromosomes within Fixed Nuclei
A GM18507 limfocita sejtvonalból származó 3:1 metanol:ecetsav arányban rögzített sejtmagban az interfázisú kromoszómákhoz kötött DAPI élettartamát is leképeztük, amint az a 6. ábrán látható. A sejtmagról többfotonos gerjesztésű (760 nm-en) konfokális mikroszkóppal készítettünk z-halmazt. A 6a,c ábrán az eredeti fókuszsíktól (6b. ábra) -0,50 μm, illetve +0,50 μm távolságban készült képek láthatók.
Kiválasztott fókuszsíkok a GM18507 sejtek interfázisú sejtmagjáról készült élettartam-képek z-halmazából (a) -0,50 μm, (b) 0 μm és (c) +0.50 μm-es fókusz (skálasávok = 5 μm, lásd az S5. ábrán a z-halmaz összes fókuszsíkját).
A DAPI-fluoreszcencia csökkenése egyetlen exponenciális karaktert mutatott. A mért sejtmag élettartam-képek azt mutatják, hogy a DAPI élettartama erősen változik az interfázisú sejtmagban, ahol rövid élettartamú lokalizált régiók figyelhetők meg (a 6. ábrán nyilakkal jelezve). Annak ellenére, hogy a rögzített mag a rögzítési folyamat következtében a natív gömb alakjához képest kissé összeesett, ez három dimenzióban mutatja a rövid élettartamú régiók helyét. A konfokális z-stack képek 3D rekonstrukcióját (lásd az S4. ábrát) és a rövid élettartamú régiók kvantitatív elemzését az Avizo szoftver segítségével végeztük el.
A 4. táblázat a rövid élettartamú régiók térfogatát, átlagos élettartamát és a mag sugarához viszonyított helyzetét mutatja. A rövid élettartamú régiók számított térfogata nagyobbnak bizonyult, mint egy metafázisú kromoszóma tipikus térfogata (~1-3 um3 ), ami a kromatin jelentős dekompakciójára utal az interfázisban. A rövid élettartamú régiók helyzetét kiszámítottuk, hogy meghatározzuk, van-e preferenciális helyük a sejtmagban. A táblázatból megfigyelhető, hogy a rövid élettartamú régiók közelebb helyezkednek el a perifériához, mint a sejtmag közepéhez. Ebben a vizsgálatban három magot vizsgáltunk, és azt találtuk, hogy mindegyikben hasonlóan oszlanak el a rövid élettartamú régiók (a másik két magot lásd az S6. és S7. ábrán).
A 3:1 metanol:ecetsavban rögzített CCD37LU tüdő fibroblaszt sejtekből származó magon belüli, DAPI-val festett interfázisú kromoszómákat is megmértük, amint az a 7a. ábrán látható. A képen rövid élettartamú régiók jelenléte látható a sejtmagon belül, hasonlóan a GM18507 limfocita sejtekben megfigyeltekhez. A rövid élettartamú régióknak azonban nincs preferenciális elhelyezkedésük a sejtmagon belül. A 7b. ábra a mért sejtmag FISH-képét mutatja. A 9-es kromoszóma centromer szondája piros színnel látható a képen. A 7a,b ábrát összehasonlítva megfigyelhető, hogy a 9. kromoszóma centromer szondájának helye átfedésben van a két rövid élettartamú régióéval. Egy másik mért sejtmag hasonló eredményt mutat, és az S8. ábrán látható.
FLIM a CCD37LU sejtek interfázisú sejtmagjáról.
(a) A sejtmag élettartam képe. A piros szaggatott négyzetbe zárt rövid élettartamú régiókat a 9-es kromoszóma részeként azonosítottuk (skálasáv = 5 μm). (b) A mért sejtmag FISH-felvétele, amely mutatja a 9-es kromoszómához tartozó centromer-szonda helyét (méretarányos sáv = 5 μm). A szonda helye átfedésben van a 7a. ábrán mellékelt rövid élettartamú régiók helyével.