L’utilisation de l’imagerie de durée de vie de la fluorescence du DAPI pour étudier la condensation de la chromatine dans les chromosomes humains

Caractéristiques de l’état excité du DAPI libre et du DAPI lié à l’ADN

La durée de vie de l’état excité du DAPI est bien connue26, nous avons donc mesuré la durée de vie du DAPI non lié dans une solution PBS (pH 7.2) pour déterminer à la fois la sensibilité du système et la précision des mesures de durée de vie. La décroissance de la fluorescence a montré un caractère exponentiel double : les composantes de la durée de vie de la fluorescence, τ et les coefficients d’intensité, a, sont indiqués dans le tableau 1. La valeur de la composante de longue durée de vie s’accorde bien avec la littérature tandis que la valeur de la composante de courte durée de vie est supérieure à celle décrite dans la littérature à pH 7 où la plage de valeurs est de 0,19-0,24 ns26.

Nous avons ensuite mesuré les durées de vie du DAPI lié à l’ADN contenant différentes quantités de bases AT et GC pour déterminer si la composition des bases de l’ADN a un effet sur la durée de vie du DAPI. Les ADN de thymus de veau (CT) et de micrococcus luteus (ML) ont été utilisés pour cette partie de l’étude en raison de leur composition différente en paires de bases (42% de GC pour l’ADN CT et 72% de GC pour l’ADN ML). Trois solutions de chacun des ADN CT et ML ont été mesurées. Les durées de vie du DAPI pour chaque type d’ADN présentaient deux composantes (tableau 1). La composante de courte durée de vie du DAPI lié à l’ADN ML est légèrement supérieure à celle de l’ADN CT (différence de 130 ps). Il n’y a pas de différence significative observée entre les composantes à longue durée de vie.

FLIM de DAPI lié à des chromosomes de métaphase fixés à partir de lymphocytes B

La figure 1a montre une image de durée de vie d’un « étalement » typique de chromosomes de métaphase humains fixés dans du méthanol:acide acétique 3:1 (voir Méthodes pour la définition de l’étalement chromosomique). Une image élargie de la région fermée de la figure, prise à une résolution de pixels plus élevée, est présentée à la figure 1b. La fausse couleur est utilisée pour représenter la valeur de la durée de vie à chaque pixel de l’image.

Les deux figures montrent qu’il existe une variation de la durée de vie du DAPI sur la longueur des chromosomes. Les courbes de décroissance de la fluorescence du DAPI avec les intensités normalisées sont également présentées dans la figure 1b pour compléter les images de durée de vie et montrent que la fluorescence des molécules de DAPI dans les régions rouges a une décroissance plus rapide que celle des régions bleues. La durée de vie moyenne ± l’écart type (ET) du DAPI pour l’étalement chromosomique mesuré sur la figure 1a a été déterminée comme étant de 2,91 ± 0,12 ns ; la décroissance de fluorescence du DAPI s’est avérée avoir une caractéristique exponentielle unique.

Identification des régions hétéromorphes dans les chromosomes

Douze étalements chromosomiques (cellules GM18507) avec 46 chromosomes chacun ont été mesurés à partir de trois lames. La figure 2a montre une image de durée de vie de l’un des étalements mesurés. Dans chacun des étalements mesurés, nous avons constaté que certains chromosomes ont des régions spécifiques sur leur longueur qui ont des durées de vie significativement plus courtes que le reste du chromosome, principalement à proximité des centromères. Ces régions apparaissent en rouge dans les images de durée de vie en raison de l’échelle de couleurs utilisée ; nous les appellerons les régions à courte durée de vie.

Les courbes de distribution de la durée de vie avec les fréquences normalisées pour les régions à courte durée de vie et le reste des chromosomes de la Fig. 2a sont présentées dans la Fig. 2b. La durée de vie moyenne ± SD des molécules de DAPI dans les régions à courte durée de vie de la Fig. 2a a été déterminée comme étant de 2,48 ± 0,13 ns tandis que celle des molécules dans le reste des chromosomes de l’étalement a été déterminée comme étant de 2,80 ± 0,09 ns. Les écarts types représentent la variation des valeurs de durée de vie au sein des régions à courte durée de vie et du reste des chromosomes pour l’étalement mesuré.

Nous avons soupçonné que les régions à courte durée de vie correspondaient à des régions hétéromorphes dans les chromosomes. De telles régions présentent des variations de morphologie à des endroits spécifiques tout en n’affectant pas le phénotype et sont souvent de nature hétérochromatique. Les variations morphologiques connues des régions hétéromorphes ont été associées à la longévité et à l’infertilité et présentent donc un grand intérêt pour les études génétiques. Les régions hétéromorphes sont connues pour se produire sur les chromosomes 1, 9, 15, 16 et le chromosome Y27.

Il a été décidé de réaliser des expériences mFISH (voir Méthodes) sur tous les étalements mesurés afin d’identifier les chromosomes contenant les régions à courte durée de vie. L’image mFISH et le caryotype de l’étalement de la Fig. 2a sont présentés dans les Fig. 2c,d, respectivement. Les régions présentant des durées de vie plus courtes, par rapport au reste des chromosomes, dans tous les étalements mesurés ont été identifiées comme étant les régions péricentromériques des chromosomes 1, 9 et 16, le bras court du chromosome 15 et la région distale du chromosome Y ; ces régions sont connues pour être des régions hétéromorphes, confirmant notre hypothèse.

Le tableau 2 montre la valeur de durée de vie moyenne du DAPI pour chacune des régions hétéromorphes de la Fig. 2a. Comme chaque autosome apparaît deux fois, les durées de vie moyennes et les écarts types pour les régions hétéromorphes obtenus pour les autosomes ayant le même numéro de chromosome ont été moyennés et mis en commun, respectivement.

On peut observer dans ce tableau que les durées de vie mesurées pour les régions hétéromorphes des chromosomes 1, 16 et Y sont similaires et sont significativement plus longues que celles des chromosomes 9 et 15. La région hétéromorphe du chromosome 9 peut être décrite par deux durées de vie de sorte que la région 9a a une valeur similaire à celle du chromosome 15 tandis que la région 9b a une durée de vie plus courte que celle de la région 9a.

Les autres étalements mesurés (voir les tableaux S1-S11 dans les matériaux supplémentaires) montrent une tendance similaire des régions hétéromorphes des chromosomes 9 et 15 ayant des durées de vie plus courtes que celles des chromosomes 1, 16 et Y.

Tendances de la durée de vie du DAPI avec la surface des chromosomes

Les chromosomes sont connus pour devenir progressivement plus compacts à l’approche du stade de métaphase du cycle cellulaire ; le Colcemid a été utilisé pour cette étude afin de bloquer les cellules à ce stade avant la récolte. Cependant, les cellules de la population synchronisée ne sont pas toutes censées se trouver exactement au même stade de condensation lors de la récolte. Cette variation de la compaction se reflète dans la variation de la surface relative d’un chromosome particulier d’un étalement chromosomique à un autre sur la même lame, les chromosomes les plus compacts ayant des surfaces plus petites. Nous avons anticipé que les différents états de compaction pourraient avoir un effet sur les durées de vie de fluorescence observées. Pour mesurer l’effet de la compaction de la chromatine sur les durées de vie, nous avons corrélé les durées de vie moyennes du DAPI pour divers exemples de chromosomes 1 (cellules GM18507) provenant d’une lame et de leurs régions hétéromorphes avec la surface mesurée du chromosome. Comme décrit précédemment, les valeurs de durée de vie des paires de chromosomes ont été moyennées, les pixels ont reçu une couleur en fonction de la valeur de durée de vie et les régions à courte durée de vie (régions rouges) ont été considérées comme étant de nature hétéromorphe. La segmentation et l’analyse des régions hétéromorphes et le calcul des aires des chromosomes ont été effectués à l’aide du logiciel Avizo.

Le graphique de la figure 3 montre que les durées de vie moyennes du DAPI pour le chromosome 1 et sa région hétéromorphe diminuent fortement avec la diminution de l’aire du chromosome 1. Dans la mesure où la surface d’un chromosome dans un étalement représente la densité de l’emballage, la tendance observée suggère une dépendance linéaire de la densité, représentant le degré de condensation. Une tendance similaire est également observée pour les étalements de chromosomes sur une autre lame (voir figure S1).

Effet de la concentration de DAPI sur la durée de vie

Les durées de vie moyennes du DAPI pour divers chromosomes 1 (cellules GM18507) colorés avec différentes concentrations de DAPI ont été mesurées pour déterminer l’effet de la concentration de DAPI sur la durée de vie. Douze chromosomes 1, ayant approximativement la même surface, provenant de la même lame ont été mesurés pour chaque concentration.

On peut observer dans le tableau 3 que l’intensité totale du chromosome 1 augmentait avec la concentration de DAPI. Cependant, aucune variation significative n’a été observée dans la durée de vie du DAPI entre les différentes concentrations.

FLIM du Hoechst 33258 lié aux chromosomes de métaphase fixes

Afin de confirmer que les variations de durée de vie que nous avons observées sur la longueur des chromosomes est une fonction de la structure de la chromatine et n’est pas due à des effets spécifiques au DAPI, nous avons effectué une FLIM en utilisant un autre colorant de liaison au sillon mineur. Des chromosomes en métaphase (cellules GM18507) fixés dans du méthanol:acide acétique 3:1 ont été colorés avec du Hoechst 33258.

La figure 4 montre l’image de durée de vie de l’étalement chromosomique mesuré. La décroissance de la fluorescence du Hoechst 33258 lié aux chromosomes s’est avérée avoir des caractéristiques exponentielles uniques, similaires à celles du DAPI. La durée de vie moyenne ± SD du Hoechst 33258 pour l’étalement mesuré a été déterminée comme étant de 2,42 ± 0,05 ns. L’écart-type plus faible, comparé à celui des chromosomes colorés au DAPI (0,12 ns), montre que la variation de la durée de vie du Hoechst 33258 sur l’étalement n’est pas aussi élevée que celle observée pour les chromosomes colorés au DAPI. L’image de la durée de vie montre que les régions hétéromorphes des chromosomes 1, 9, 15, 16 et Y affichent des valeurs de durée de vie significativement plus courtes que le reste des chromosomes (voir Figure S2 pour l’image mFISH et le caryotype), similaires à celles observées pour les chromosomes colorés au DAPI. La durée de vie moyenne ± SD des molécules de Hoechst 33258 dans les régions hétéromorphes a été déterminée comme étant de 2,36 ± 0,03 ns alors que celle des molécules dans le reste des chromosomes dans l’étalement a été déterminée comme étant de 2,43 ± 0,04 ns. Les valeurs moyennes de durée de vie du Hoechst 33258 et les écarts types pour chacune des régions hétéromorphes des chromosomes 1, 9, 15, 16 et Y, par rapport au reste du chromosome, sont présentés dans le tableau S12.

Cette expérience supplémentaire utilisant le Hoechst confirme que les variations de durée de vie observées sur la longueur des chromosomes sont dues à la structure locale de la chromatine et non au fluorophore utilisé.

FLIM de DAPI lié à des chromosomes en métaphase fixés de cellules HeLa

Des mesures deFLIM sur des chromosomes en métaphase colorés au DAPI obtenus à partir de cellules HeLa fixées dans du méthanol:acide acétique 3:1 ont également été effectuées pour vérifier que les variations de la durée de vie du DAPI observées sur la longueur des chromosomes ne sont pas seulement spécifiques à la lignée cellulaire mais sont dues à la structure générale de la chromatine.

La figure 5a montre l’étalement chromosomique mesuré. La durée de vie moyenne ± SD du DAPI pour l’étalement mesuré a été déterminée comme étant de 2,93 ± 0,09 ns. Des durées de vie plus courtes du DAPI, par rapport au reste des chromosomes, sont observées dans les régions hétéromorphes des chromosomes 1, 9, 15, 16 et Y (voir la figure S3 pour l’image mFISH et le caryotype), comme cela a été observé pour les cellules GM18507. Quatre chromosomes anormaux constitués d’une partie du chromosome 1 ou 9 présentaient également des durées de vie du DAPI plus courtes dans leurs régions péricentromériques, ce qui suggère qu’ils contiennent la région hétéromorphe du chromosome 1 ou 9. Les courbes de distribution de la durée de vie avec les fréquences normalisées pour les régions à durée de vie courte et le reste des chromosomes sont présentées dans la figure 5b. La durée de vie moyenne des molécules de DAPI dans les régions à courte durée de vie a été déterminée comme étant de 2,68 ± 0,08 ns, tandis que celle des molécules dans le reste des chromosomes de l’étalement a été déterminée comme étant de 2,93 ± 0,08 ns.

FLIM du DAPI lié aux chromosomes interphasés à l’intérieur de noyaux fixés

La durée de vie du DAPI lié aux chromosomes interphasés à l’intérieur d’un noyau fixé 3:1 méthanol:acide acétique de la lignée cellulaire lymphocytaire GM18507 a également été imagée, comme le montre la figure 6. Une pile z du noyau a été prise à l’aide d’un microscope confocal à excitation multiphotonique (à 760 nm). Les figures 6a,c montrent les images obtenues à -0,50 μm et +0,50 μm, respectivement, à partir du plan focal original (figure 6b).

Un seul caractère exponentiel a été observé pour la décroissance de la fluorescence DAPI. Les images de durée de vie du noyau mesuré montrent qu’il existe une forte variation de la durée de vie du DAPI à travers le noyau en interphase, où des régions localisées de courtes durées de vie peuvent être observées (indiquées par des flèches sur la figure 6). Même si le noyau fixé est quelque peu écrasé par rapport à sa forme sphérique native en raison du processus de fixation, cela montre les emplacements des régions à courte durée de vie en trois dimensions. La reconstruction 3D des images confocales en z (voir figure S4) et l’analyse quantitative des régions à courte durée de vie ont été réalisées à l’aide du logiciel Avizo.

Le tableau 4 montre le volume, la durée de vie moyenne et la position par rapport au rayon du noyau des régions à courte durée de vie. Les volumes calculés pour les régions à courte durée de vie s’avèrent être plus grands que le volume typique d’un chromosome en métaphase (~1-3 um3), ce qui suggère une décompaction considérable de la chromatine en interphase. Les positions des régions à courte durée de vie ont été calculées pour déterminer si elles ont des emplacements préférentiels dans le noyau. On peut observer dans le tableau que les régions à courte durée de vie sont situées plus près de la périphérie que du centre du noyau. Nous avons examiné trois noyaux dans cette étude et avons constaté qu’ils présentaient tous une distribution similaire de régions à courte durée de vie (voir les figures S6 et S7 pour les deux autres noyaux).

Les chromosomes interphasés colorés au DAPI dans un noyau de cellules de fibroblastes pulmonaires CCD37LU fixées dans du méthanol:acide acétique 3:1 ont également été mesurés, comme le montre la figure 7a. L’image montre la présence de régions à courte durée de vie dans le noyau, similaire à celle observée dans les cellules lymphocytaires GM18507. Cependant, les régions à courte durée de vie n’ont pas de localisation préférentielle dans le noyau. La figure 7b montre l’image FISH du noyau mesuré. La sonde du centromère du chromosome 9 est représentée en rouge sur l’image. En comparant les figures 7a et b, on peut observer que l’emplacement de la sonde du centromère du chromosome 9 chevauche celui des deux régions à courte durée de vie. Un autre noyau mesuré montre un résultat similaire et est présenté dans la figure S8.

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