Takaisin perusteisiin – Mikä on immunomääritys – Ladattava PDF-versio
Mikä on immunomääritys tai ELISA?
Immunomääritykset ovat nopeita ja tarkkoja testejä, joita voidaan käyttää paikan päällä ja laboratoriossa spesifisten molekyylien osoittamiseen. Immunomääritykset perustuvat vasta-aineen luontaiseen kykyyn sitoutua molekyylin tiettyyn rakenteeseen. Vasta-aineet ovat proteiineja, joita eläimet tuottavat vastauksena vieraan molekyylin (antigeenin) tunkeutumiseen elimistöön. Vasta-aineita on veressä ja kudosnesteissä, ja ne sitoutuvat antigeeniin aina, kun se kohdataan. Koska vasta-aineet on kehitetty antigeenin tai analyytin tiettyä kolmiulotteista rakennetta varten, ne ovat erittäin spesifisiä ja sitoutuvat vain kyseiseen rakenteeseen. Kun monoklonaaliset ja polyklonaaliset vasta-aineet on puhdistettu verestä, ne ovat ihanteellisia määritysreagensseja spesifisten kohdemolekyylien havaitsemiseen ja seurantaan siten, että muiden aineiden aiheuttamat häiriöt ovat vähäisiä. Neljä tyypillistä ELISA-muotoa ovat: vasta-aine-sandwich-immunomääritykset, antigeenin alaspäin suuntautuvat immunomääritykset, kilpailevat inhibitiomääritykset ja pikamääritykset.
Vasta-aine-sandwich-immunomääritys
Tyypillisessä vasta-aine-sandwich-immunomäärityksessä monoklonaalinen vasta-aine adsorboituu muoviseen mikrotitterilevyyn. Kun testinäyte lisätään levylle, levyllä oleva vasta-aine sitoo näytteen kohdeantigeenin ja pitää sen levyssä. Kun polyklonaalinen vasta-aine lisätään seuraavassa vaiheessa, se sitoutuu myös kohdeantigeeniin (joka on jo sitoutunut levyllä olevaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen), jolloin kahden eri vasta-aineen välille muodostuu antigeenin ”sandwich”.
– Vaihe 1: Monoklonaaliset vasta-aineet adsorboidaan muovisen mikrotiterilevyn kuoppaan päällystyspuskurilla (näytettä ei ole lisätty).
– Vaihe 2: Näytteen (esim. ihmisveri, sopivasti laimennettuna) lisääminen mikrotiterilevyn kuoppaan. Kohdeantigeeni sitoutuu levylle adsorboituneeseen vasta-aineeseen, jolloin antigeeni pysyy kuopassa.
– Vaihe 3: Entsyymikonjugoidun polyklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen kohdeantigeeniin (joka on sitoutunut levyllä olevaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen), jolloin muodostuu antigeeni-”sandwich” kahden eri vasta-aineen välille.
– Vaihe 4: Kolorimetrisen substraatin lisääminen entsyymikonjugoitujen polyklonaalisten vasta-aineiden havaitsemiseksi tuottaa värisignaalin, joka on verrannollinen kohdeantigeenin määrään, joka on läsnä levylle lisätyssä alkuperäisessä näytteessä.
Antigeenin alentava (immuniteettitesti) immunomääritys
Antigeenin alentavassa (immuniteettitestiä suorittavassa) immunomäärityksessä analysoitava aine päällystetään, jolloin sitä käytetään näytteestä löytyneiden vasta-aineiden sitoutumiseen. Kun näyte lisätään (esimerkiksi ihmisen seerumi), levyn antigeeni sitoutuu näytteestä peräisin oleviin vasta-aineisiin (esimerkiksi IgE), jotka sitten jäävät kuoppaan. Seuraavaksi lisätään HRP:llä leimattu lajispesifinen vasta-aine (esimerkiksi anti-human IgE), joka sitoutuu levyn antigeeniin sitoutuneeseen vasta-aineeseen. Mitä suurempi signaali on, sitä enemmän näytteessä on vasta-aineita. Antigen-down (immuniteettitesti) -määritykset voidaan konfiguroida pikatesteiksi, ja niitä käytetään usein allergiatilojen diagnosointiin – rutiininomaisesti potilaan verta testataan eri allergeeneja vastaan, jotta nähdään, onko henkilöllä vasta-aineita kyseistä allergeenia vastaan.
Kilpailullinen inhibitioimmunomääritys
Monoklonaalisen-polyklonaalisen (Mo-Po) vasta-aineen voileipä-muodon lisäksi monet immunomääritykset ovat rakenteeltaan kilpailullisen inhibitioimmunomääritysmuodon mukaisia. Kompetitiivista inhibitiomääritystä käytetään usein pienten analyyttien mittaamiseen, koska kompetitiivinen inhibitiomääritys edellyttää vain yhden vasta-aineen sitoutumista eikä kahta, kuten tavanomaisissa ELISA-muodoissa. Koska on erittäin todennäköistä, että kahden vasta-aineen yrittäessä sitoutua pieneen molekyyliin samanaikaisesti syntyy steriittinen este, sandwich-malli ei välttämättä ole toteutettavissa. Siksi kilpailullinen inhibitiomääritys olisi suositeltavampi.
Sekventiaalisessa kilpailullisessa inhibitiomäärityksessä näyte ja konjugoitu analyytti lisätään vaiheittain kuten sandwich-määrityksessä, kun taas klassisessa kilpailullisessa inhibitiomäärityksessä näitä reagensseja inkuboidaan yhdessä samanaikaisesti. Sekventiaalisessa kilpailevassa inhibitiomääritysmuodossa monoklonaalinen vasta-aine päällystetään 96-kuoppaiselle mikrotitterilevylle. Kun näyte lisätään, MoAb vangitsee vapaan analyytin näytteestä. Seuraavassa vaiheessa lisätään tunnettu määrä analyyttiä, joka on leimattu joko biotiinilla tai HRP:llä. Myös leimattu analyytti yrittää tällöin sitoutua levylle adsorboituneeseen MoAb:hen, mutta näytteestä aiemmin sitoutunut analyytti estää leimattua analyyttiä sitoutumasta MoAb:hen. Tämä tarkoittaa, että levyllä oleva monoklonaalinen aine ei sido leimattua analyyttiä, jos monoklonaalinen aine on jo sitonut näytteestä peräisin olevaa leimaamatonta analyyttiä. Merkitsemättömän analyytin määrä näytteessä on kääntäen verrannollinen merkityn analyytin tuottamaan signaaliin. Mitä pienempi signaali on, sitä enemmän näytteessä on leimaamatonta analyyttiä. Standardikäyrä voidaan muodostaa käyttämällä leimaamattoman analyyttistandardin sarjalaimennoksia. Seuraavat näytearvot voidaan sitten lukea standardikäyrästä, kuten sandwich-ELISA-muodoissa tehdään. Klassinen kilpailullinen inhibitiomääritysformaatti edellyttää leimatun (konjugoidun analyytin) ja leimaamattoman analyytin (näytteestä) samanaikaista lisäämistä. Sekä leimattu että leimaamaton analyytti kilpailevat sitten samanaikaisesti levyn monoklonaalisen sieppausvasta-aineen sitoutumiskohdasta. Kuten peräkkäisessä kilpailevassa inhibitiomuodossa, värillinen signaali on kääntäen verrannollinen leimaamattoman kohdeanalyytin pitoisuuteen näytteessä. Merkityn analyytin havaitseminen voidaan tehdä käyttämällä peroksidaasisubstraattia, kuten TMB:tä, joka voidaan lukea mikrotiterilevyjen lukulaitteella.
Pikaimmunomääritys
Mikrotiterilevyjen lisäksi immunomääritykset konfiguroidaan myös pikatesteiksi, kuten kotiraskaustestiksi. Mikrotiitterilevymääritysten tapaan pikatesteissä käytetään vasta-aineita reagoimaan antigeenien kanssa, ja niitä voidaan kehittää MoAb-PoAb-sandwich-muotoisina, kilpailevina inhibitiomuotoisina ja antigeenin alentamismuotoisina. Pikatestissä vasta-aine- ja antigeenireagenssit on sidottu huokoisiin kalvoihin, jotka reagoivat positiivisten näytteiden kanssa ja ohjaavat ylimääräiset nesteet kalvon ei-reaktiiviseen osaan. Pikaisia immunomäärityksiä on yleensä kahta eri kokoonpanoa: lateraalivirtaustesti, jossa näyte vain asetetaan kuoppaan ja tulos luetaan välittömästi, ja läpivirtausjärjestelmä, jossa näyte asetetaan kuoppaan, kuoppa pestään ja lopuksi lisätään analyytikkokolloidikulta-konjugaatti, jolloin tulos luetaan muutaman minuutin kuluttua. Yksi näyte testataan liuskaa tai kasettia kohti. Koska pikatestit ovat nopeampia kuin mikrotitterilevymääritykset, vaativat vain vähän näytteen käsittelyä, ovat usein halvempia ja tuottavat kyllä/ei-vastauksia ilman laitetta, niitä käytetään usein kentällä laboratorioon kuulumattomien henkilöiden testatessa kokonaisia näytteitä. Immunopikatestit eivät kuitenkaan ole yhtä herkkiä eikä niitä voida käyttää analyytin tarkkaan kvantifiointiin (diabeetikoiden suorittamaa verensokerin omaseurantaa pidetään kvantitatiivisena pikatestauksena, mutta näissä testeissä ei käytetä immunomääritystekniikkaa). Kaikki immunopikatestit voidaan muuntaa mikrotiitterilevymääritykseksi, mutta kaikkia mikrotiitterilevymäärityksiä ei voida muuntaa pikatestiksi.
