Tulokset ja keskustelu
R.KpnI:n DNA:n pilkkomisen kaksi eri tapaa Mg2+:n läsnäollessa.
R.KpnI on Mg2+:n katalysoimien reaktioiden suhteen hyvin promiskuusi REaasi, toisin kuin suurin osa muista REaaseista (11, 12). Kuvassa 1 A on esitetty R.KpnI:n tyypillinen pilkkomiskuvio eri Mg2+ -pitoisuuksissa. Pienemmillä metalli-ionin pitoisuuksilla (50-500 μM) havaittiin vain tunnetun sekvenssin pilkkoutumista (kaistat 2-5). Mg2+ >500 μM:n pitoisuuksissa oli kuitenkin havaittavissa monipuolista pilkkoutumista (kaistat 6-9). R.KpnI:n spesifinen ja promiscuoottinen pilkkomistapa Mg2+ -pitoisuudesta riippuen vahvistettiin analysoimalla oligonukleotidien pilkkomista. R.KpnI pilkkoi kanonisen sekvenssin sisältävän oligonukleotidisubstraatin tehokkaasti jopa 20 μM Mg2+:ssa. Sitä vastoin ei-kanoniset sekvenssit pilkkoutuivat tehokkaasti vain >500 μM Mg2+ :ssa. Nämä tulokset osoittivat, että R.KpnI:llä on kaksi erilaista metallien aktivointiprofiilia – yksi kanonisille ja toinen ei-kanonisille DNA-substraateille. Entsyymi noudattaa hyperbolista metalliaktivointiprofiilia kanoniselle substraatille ja sigmoidista mallia ei-kanoniselle substraatille (kuva 1 B). Näille tiedoille tehtiin Hill plot -analyysi (kuva S2; ja katso SI Text ), ja metalli-ionin sitoutumisen Hill-kerroin on esitetty taulukossa 1. Hill plot -analyysi paljasti ylimääräisen metalli-ionin sitoutumisen entsyymiin ja sen roolin ei-kanonisten sekvenssien pilkkomisessa. Näin ollen näytti siltä, että ylimääräisen metalli-ionin rekrytoituminen lähelle tai kauas entsyymin aktiivisesta kohdasta oli välttämätöntä, jotta entsyymi voisi saada aikaan promissiivisen pilkkomisen. Jos näin on, toisen kohdan metalli-ionin koordinointiin osallistuvien jäännösten mutaatioiden pitäisi poistaa sekvenssispesifinen aktiivisuus, jolloin tuloksena olisi erittäin sekvenssispesifinen entsyymi. Testasimme tätä hypoteesia.