Nukleotidien ja nukleosidien integroitu synteesi aminohappojen vaikutuksesta

Glykosylaatiotuotteiden samanaikainen muodostuminen

Nukleosidi- ja nukleotidirakenteiden muodostuminen yksinkertaisista lähtöaineista onnistui samanaikaisesti kolmella nukleobaasilla dehydraatioreaktioilla. Tämä on ristiriidassa aikaisempien tällä alalla tehtyjen töiden kanssa, joissa olosuhteet optimoitiin tiettyjen tuotteiden suosimiseksi24,25,26. Tyypillisessä glykosylaatiokokeessa adeniinia ja P-riboosia kuumennettiin 90 °C:ssa 5 tunnin ajan pH:n ollessa 2,5. Havaittiin adeniinimonofosfaattinukleotidin (AMP) (ja sen isomeerien) muodostumista, kun adeniini ja P-riboosi yhdistettiin. Tuotteiden HPLC-MS-analyysistä saadut uutettujen ionien kromatogrammit (EIC) paljastivat useita piikkejä, joiden m/z vastaavat + ja + (täydentävät kuvat 13-15). Vertailu standardeihin vahvisti, että AMP vastaa piikkiä, joka havaittiin RT = 4,2 minuutin kohdalla (täydentävät kuvat 5 ja 6); muut suuret piikit saattavat vastata AMP-isomeerejä, kuten N6-ribosyloitua isomeeria. Tämän vahvistamiseksi tehtiin hydrolyysireaktio NaOH:n (0,1 M) läsnäollessa, jotta eri isomeerit voitaisiin erottaa toisistaan, koska N6-ribosyloitu isomeeri on alttiimpi hydrolyysille. Piikeissä on kuitenkin havaittavissa lievää häiriötä, mikä vaikeuttaa N6-ribosyloidun isomeerin identiteetin varmistamista. Tämän jälkeen analysoimme kahden eri isomeerin (adenosiini-3′-monofosfaatti ja adenosiini-5′-monofosfaattimonohydraatti) kaksi puhdasta standardia yksittäin ja seoksessa selvittääksemme isomeerien eluutioprofiilia (täydentävät kuvat 148, 149). Standardiseoksessa voidaan havaita retentioajan siirtymä, joka korreloi paremmin näiden yhdisteiden eluution kanssa todellisessa näytteessä. Vaikka isomeerien erottaminen toisistaan on vaikeaa, voimme vahvistaa vähintään kahden isomeerin esiintymisen AMP-tuotteissa vertaamalla standardiseoksen eluointiprofiilia todelliseen näytteeseen. Nyt on selvää, että erilaisten isomeerien muodostuminen (täydentävä kuva 12) on mahdollinen syy siihen, että nukleotidit eluoituvat samoilla massoilla eri retentioajoilla. Lisäksi reaktiotuotteidemme MS/MS-analyysi paljastaa AMP:n (ja sen isomeerien) fragmentoitumisen adeniiniksi (m/z = 136,0617 ± 0,01) (Täydentävä kuva 20); tämä on yhdenmukainen kanonisen AMP-standardin fragmentoitumisen kanssa. Ehdotettu reaktiomekanismimme koostuu glykosidisidoksen muodostumisesta riboosin 1′-OH-ryhmän ja adeniinin aminoryhmän välille (ks. täydentävä kuva 12).

Aikakäyräreaktiot osoittavat, että veden haihtuminen on tärkein liikkeellepaneva voima glykosylaatiotuotteiden muodostumisessa, ja niissä näkyy nukleosidi- ja nukleotidirakenteiden muodostumisen merkittävä lisääntyminen 2 ja 4 tunnin välisenä aikana (kuva 2a). Tämä vastaa ajanjaksoa, jolloin näytetilavuus pienenee voimakkaasti ja reagenssit ovat erittäin konsentroituneita. Kun reaktio on kestänyt 5-6 tuntia, näyte kuivuu ja reaktionopeus (jota seuraa intensiteetti HPLC-MS-mittauksissa) vakiintuu. AMP:n lisäksi glykosidisidoksia sisältävät tuotteet, mukaan lukien sykliset nukleotidit (esim. cAMP)27 ja nukleosidit (esim. adenosiini), havaittiin RP-HPLC-MS:llä, MS/MS:llä ja testattiin 1,N6-eteenijohdannaisten muodostumisen varalta28,29 , mikä vahvistettiin vertailemalla niitä standardeihin (kuva 2, lisäkuvat 7-11, lisäkuvat 23-27). Kanonisten 2′,3′-cAMP- ja 3′,5′-cAMP-standardien retentioajat eivät vastanneet näytteen EIC-piikkien retentioaikoja. Massajakaumat (+; +) ja fragmentaatiokuviot (+) olivat kuitenkin identtiset (täydentävät kuvat 16-21). Nämä tulokset osoittavat, että vaikka syklisiä rakenteita muodostuu, kanoninen cAMP ei ole päätuote. Vertailu adenosiinin analyyttiseen standardiin osoittaa myös, että P-riboosin ja adeniinin kondensaatioreaktiossa muodostuu adenosiinia ja useita isomeerisiä lajeja (täydentävät kuvat 18-22). Vaikka AMP:n ja adenosiinin kanoniset muodot vahvistettiin näissä kokeissa, ne eivät olleet dehydraatioreaktion päätuotteita.

Kun fosfaattia annettiin erikseen pyrofosfaattina ja se reagoi adeniinin ja riboosin kanssa, havaittiin yhdiste, jolla oli adenosiinin massa, ja havaittiin vähän AMP:tä ja cAMP:ia, ja adenosiinia muodostui edelleen myös silloin, kun fosfaattilähdettä ei ollut läsnä (Täydentävät kuvat 33-41). On syytä huomata, että olemme tarkoituksella keskittyneet tutkimuksissamme fosforyloitujen tuotteiden (AMP-isomeerien ja cAMP-isomeerien) tunnistamiseen ja kiinnittäneet vähemmän huomiota sellaisten fosforyloitujen tuotteiden tunnistamiseen, jotka eivät ole AMP-isomeerejä ja cAMP-isomeerejä30,31,32. Ehdotamme, että riboosin hydroksyyliryhmän ja adeniinin aminoryhmän välille muodostuu glykosidisidos, joka käynnistyy vesimolekyylin haihtumisen seurauksena. Adeniinin primaaristen ja sekundaaristen amiiniryhmien suhteellista reaktiivisuutta on tutkittu hyvin33 , ja ilman aktivointia tai suojaryhmän läsnäoloa glykosidinen sidos primaarisen amiinin kohdalla on yleensä ensisijainen. Tämän vuoksi adenosiinin/AMP:n kanonisen isomeerin ei odoteta olevan merkittävä tuote, koska se edellyttäisi reaktiota yksinomaan sekundaarisessa amiinissa. Reaktiivisuus on kuitenkin riittävän suuri sekundaarisen amiinin kohdalla, jotta kanonisia isomeerejä voi muodostua, vaikkakaan ei päätuotteena. Muissa nukleobaaseissa, kuten guaniinissa, on vieläkin enemmän saavutettavissa olevia amiiniryhmiä, ja isomeeristen tuotteiden mahdollisuus on suurempi. Riboosin reaktiivisuus tapahtuu todennäköisesti pääasiassa anomeerisen aseman kautta, mikä johtaa pienempään määrään mahdollisia isomeerejä, vaikkakin joitain muitakin pienempiä tuotteita voidaan havaita.

Tämän lisäksi tutkittiin muiden kanonisten nukleobaasien (sytosiini, guaniini ja tymiini) reaktiivisuutta P-riboosin kanssa. Nukleosidi- ja nukleotidirakenteita vastaavat massat havaittiin guaniinin ja sytosiinin dehydraatioreaktion jälkeen P-riboosin kanssa (kuva 3 ja täydentävät kuvat 50-64). Guaniiniglykosylaatiorakenteita muodostui suhteellisen vähän, mikä johtuu todennäköisesti guaniinin rajallisesta liukoisuudesta alhaisessa pH:ssa. Mitatut tuotemäärät 5-metyyliuridiinimonofosfaatille (m5UMP) ja 5-metyyliuridiinille (tymiininukleosidi) olivat jopa pienempiä kuin niiden guaniinista ja sytosiinista saadut vastineet (kuva 3 ja täydentävät kuvat 65, 66). Nämä tulokset voidaan selittää sillä, että guaniinissa ja sytosiinissa on primaarinen aminoryhmä, joka puuttuu tymiinistä. Vaikka kaikilla kolmella nukleobaasilla on sekundaarisia amiiniryhmiä, ne ovat vähemmän reaktiivisia glykosidisidosten muodostuksessa. Näin ollen nukleosidi- ja nukleotidirakenteiden muodostaminen sekundaarisen amiinireaktion avulla, kuten kanonisten glykosylaatiotuotteiden muodostaminen edellyttää, ei ole suotavaa nukleobaaseissa, joissa primaarisia amiineja on käytettävissä. Tällä on mielenkiintoinen vaikutus nukleiinihappokemian omaksumiseen elämän synnyssä, sillä se viittaa siihen, että kanoniset nukleotidit ovat saattaneet aluksi olla sopimattomia, kunnes oli syntynyt biokemiallinen koneisto, joka lisäsi selektiivisyyttä oikeisiin isomeereihin. Kokeissamme muodostui siis odotetusti sytosiinin ja guaniinin kanonisia nukleotidi- ja nukleosidituotteita, mutta ne eivät vastanneet havaittuja pääpiikkejä (täydentävät kuvat 42-49). Yhdistämällä nämä kaksi havaintoa (erilaiset retentioajat mutta sama massajakauma kuin kanonisilla standardeilla EIC:ssä) voimme päätellä, että guaniinin/sytosiinin ja P-riboosin dehydraatioreaktiossa muodostuneet nukleotidi- ja nukleosidilajit olivat pääasiassa kanonisten nukleotidien ja nukleosidien isomeerisiä lajeja (joitakin mahdollisia rakenteita on esitetty lisäyskuvauksissa. 50, 51).

Tyypillisesti nukleotidirakenteiden muodostaminen on suoritettu tietyissä olosuhteissa riippuen käytetystä nukleobaasista, jolloin on tähdätty tiettyyn reaktiotuotteeseen. Vaihtoehtoisena lähestymistapana päätimme sisällyttää useita nukleobaaseja samanaikaisesti reaktioon P-riboosin kanssa. Tavoitteenamme oli selvittää, muodostuuko tuotteen muodostuminen useilla nukleobaaseilla samoissa reaktio-olosuhteissa useiden tuotteiden sekoituksesta vai hallitsisiko yksi tuote. Tämä reaktio toteutettiin sisällyttämällä reaktioastiaan samanaikaisesti kaksi tai kolme nukleobaasia (adeniini, guaniini ja sytosiini) yhdessä P-riboosin kanssa. Saatiin glykosylaatiotuotteiden seos, joka koostui nukleotideista (AMP, GMP ja CMP) sekä vastaavista syklisistä nukleotideista (cAMP, cGMP ja cCMP) ja nukleosidituotteista (adenosiini, guanosiini ja sytidiini) (täydentävät kuvat 67-95). Guaniiniglykosylaatiotuotteita muodostui pienemmällä saannolla kuin adeniinin ja sytosiinin glykosylaatiotuotteita, mikä johtui odotetusti guaniinin heikosta liukoisuudesta happamissa olosuhteissa.

Nukleobaasien vaihtuminen

Nukleobaasien vaihtumista havaittiin, kun Na+AMP:ia kuumennettiin 5 tuntia 90 °C:ssa happamissa vesipitoisissa väliaineissa sytosiinin tai guaniinin kanssa. Nukleobaasinvaihto johti nukleotidi- (CMP tai GMP), syklisen nukleotidin (cCMP tai cGMP) ja nukleosidirakenteiden (sytidiini tai guanosiini) muodostumiseen (ks. täydentävät kuvat 96-102 ja täydentävä taulukko 1 semikvantitatiivisten saantojen osalta). Tässä kokeessa CMP:n ja sytidiinin intensiteetin suuntaus oli kasvava, kun taas cCMP:n intensiteetti oli suurimmillaan, kun se oli 12,5 mM, ja laski sitten, kunnes intensiteetti oli 4,0 × 104 AU (täydentävät kuvat 102a ja 155-158). Kun sytosiinipitoisuus oli 37,5 mM, yhdiste, jolla oli suurempi intensiteetti, todettiin olevan CMP, ja cCMP:n ja sytidiinin mitatut intensiteetit olivat lähes samat. CMP:n ja cCMP:n EIC:ssä havaittiin kaksi isomeeristä päälajia. CMP:n osalta havaittiin +, + ja + massoja, kun taas cCMP:n osalta havaittiin +, + ja + massoja omissa massajakaumissaan. Sytidiinin tapauksessa + oli tärkein havaittu piikki. Nämä massajakaumat vastasivat standardeissa havaittuja jakaumia. Pääisomeerien retentioajat eivät kuitenkaan vastanneet kanonista CMP:tä ja sytidiiniä. Kun AMP:tä reagoitiin kasvavien guaniinipitoisuuksien kanssa (lisäkuva 102b), kaikki kolme glykosylaatiotuotetta (GMP, cGMP ja guanosiini) saavuttivat maksimiarvon, kun guaniinipitoisuus oli 2,5 mM (lisäkuvat 160-162). Nämä tulokset olivat seurausta guaniinin rajallisesta liukoisuudesta happamassa pH:ssa, joten vaikka reaktioastiaan lisättäisiin enemmän guaniinia, liuoksen tehollinen pitoisuus pysyisi samana. Maksimiarvon jälkeen cGMP:n ja guanosiinin intensiteetti oli vakio, mikä johtui guaniinin huonosta liukoisuudesta. Kaikkien kolmen guaniiniglykosylaatiotuotteen intensiteetissä havaittiin vain pientä kasvua, kun = 37,5 mM, mikä saattoi liittyä guaniinin suurempaan läsnäoloon liuoksessa suuren lisätyn konsentraation vuoksi. GMP:n EIC:ssä havaittiin laaja alue ilman tarkkaan määriteltyjä piikkejä, vaikka kaksi pääpiikkiä erottui. + oli ainoa guaniiniyhdisteisiin liittyvä kemiallinen laji, joka havaittiin sen EIC:n massajakaumassa. Neljä piikkiä, jotka oli ryhmitelty pareittain, havaittiin, kun cGMP:n EIC:stä poimittiin MS-tiedot ja massajakaumassa näkyi + ja + -lajit. Toisaalta guanosiinin EIC:ssä näkyi kolme piikkiä, joista voimakkain osoitti +:n läsnäoloa sen massajakaumassa.

Sytosiini- ja guaniiniglykosylaatiotuotteiden muodostuminen osoitti, että reaktio-olosuhteissamme tapahtui AMP:n glykosidisidoksen pilkkoutuminen. Kun AMP:n, cAMP:n ja adenosiinin EIC:t analysoitiin, jokaisessa kromatogrammissa havaittiin useita piikkejä, mikä tukee teoriaa, jonka mukaan glykosidiset sidokset käyvät läpi dynaamisen hydrolyysin/muodostumisen dehydraatioreaktion aikana34. Sytosiini- ja guaniininukleotidien reaktioita adeniinin kanssa tutkittiin myös. CMP:n ja adeniinin dehydraatioreaktiossa ei havaittu nukleoaasinvaihtoa vastaavia tuotteita (täydentävät kuvat 103-108/a). GMP:n ja adeniinin reaktiossa havaittiin kuitenkin selvästi adeniinin glykosylaatiotuotteita (täydentävät kuvat 105-108/b). Tämä johtuu siitä, että GMP:n glykosidisidosten hydrolyysi on samoissa reaktio-olosuhteissa helpompaa kuin CMP:n34. Olemme myös toteuttaneet nukleoaasinvaihtoreaktion UMP:n ja adeniinin kanssa verrataksemme sitä adeniinin suoraan pyrimidiinianalogiin (lisäyskuva 109). Tulokset muistuttivat enemmän Täydentävässä kuvassa 108 esitettyjä CMP:n saantoja kuin GMP:n saantoja, ja saimme UMP-reaktiossa adeniinin glykosylaatiotuotteiden saannot hyvin alhaisiksi, mikä ei riitä AMP:n ja cAMP:n havaitsemiseen.

Aminohappojen vaikutus glykosylaatiotuotteiden jakaantumiseen

Kuten aiemmin mainittiin, aminohapot, nukleotidit ja niiden rakennuspalikat ovat voineet esiintyä varhaisella Maapallolla yhtäaikaisesti. Siksi prebioottisessa ympäristössä on voinut esiintyä yhteispolymerisaatioreaktion tuotteita tai jopa tuotteita, jotka ovat seurausta jostakin toisen polymeerityypin katalyyttisestä vaikutuksesta toiseen. Nukleotidien rakennusaineiden ja aminohappojen yhteisreaktiivisuuden tutkimiseksi yhden potin dehydraatiossa glysiini, yksinkertaisin aminohappo, otettiin mukaan P-riboosin ja vastaavien nukleobaasien dehydraatioreaktioihin. Glysiinin sisällyttämisellä oli selvä vaikutus glykosylaatiotuotteiden muodostumiseen, mikä aiheutti AMP-isomeerien, cAMP-isomeerien ja adenosiinin massan omaavien tuotteiden kokonaistuoton pienenemisen (kuva 4a ja täydentävät kuvat 28-32). Tämä osoittaa, että glysiinillä on rooli joko nukleotidien rakennuspalikoiden (P-riboosi ja/tai adeniini) kuluttamisessa sivureaktion kautta tai että se kiinnittyy tuoterakenteeseen ja muuttaa sen massaa. Näiden reaktioiden EIC-analyysi paljastaa piikkejä, jotka vastaavat glysiiniadduktien (AMP-Gly, cAMP-Gly, adenosiini-Gly ja adeniini-Gly) massaa (täydentävät kuvat 115-122), vaikka näitä sivutuotteita ei muodostu riittävästi, jotta ne selittäisivät kaikki havaitut muutokset. Glysiinin adduktiot vahvistettiin myös käyttämällä lähtöaineena deuteroitua glysiiniä yhdessä P-riboosin ja adeniinin kanssa, mikä aiheutti muutoksia adduktiomassojen isotooppijakaumassa (täydentävät kuvat 123 ja 124). P-riboosin ja adeniinin reaktiossa glykosylaatiotuotteiden (AMP-isomeerit, sykliset AMP-isomeerit ja adenosiini) muodostumisesta saatiin suurin puolikvantitatiivinen saanto 59 %; kuitenkin vain 46 %:n saanto saatiin, kun reaktioväliaineessa oli myös glysiiniä (täydentävä kuva 144). Kaikkien mahdollisten yksittäisten isomeerien saantojen määrittäminen on teknisesti vaikeaa, mutta joidenkin isomeerien puolikvantitatiiviset saannot voitiin määrittää käyttämällä puhtaita standardeja: Adenosiini-5′-monofosfaatti oli 38,7 % ja adenosiini-2′,3′-syklinen monofosfaatti 18,2 % glysiinin puuttuessa, kun taas glysiinin läsnä ollessa molempien isomeerien saanto oli huomattavasti pienempi (<2 %).

Glysiini vaikutti myös isomeeristen lajien jakaumaan, ja siinä havaittiin selkeitä eroja verrattuna peruspiikkikromatogrammiin (BPC) P-riboosin ja adeniinin reaktiosta glysiinin läsnäollessa ja poissaollessa (kuvio 4b ja täydentävät kuvat 110-114). Nämä tiedot viittasivat erilaisten kemiallisten lajien läsnäoloon ja siitä johtuvaan muutokseen massajakaumassa reaktioiden välillä glysiinin kanssa ja ilman glysiiniä. Tämän jälkeen analysoitiin kunkin adeniiniglykosylaatiotuotteen yksittäiset EIC:t. Tuloksena havaittiin selkeitä eroja piikkien suhteellisissa intensiteeteissä, kun glysiiniä lisättiin. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että glysiinillä on selektiivinen vaikutus siihen, mitkä isomeeriset lajit muodostuvat ensisijaisesti. Glysiinin tiedetään reagoivan helposti muiden amiinien kanssa dehydratoivissa olosuhteissa12 , ja se todennäköisesti reagoi nukleobaasien primaaristen amiinien kanssa. Glysiiniä sisältäviä hybridejä sivutuotteita (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosiini, Gly-Adeniini) havaittiin ~1 %:n saannolla (lisäkuva 145), mutta tällä pienellä prosenttiosuudella on kuitenkin merkittävä vaikutus adeniiniglykosylaatiotuotteiden isomeeriseen jakaumaan (ks. lisäkuvat 146, 147). Hybridituotteiden massojen isotooppijakauman muutos havaittiin (Täydentävät kuvat 123, 124), kun deuteroitua glysiiniä otettiin mukaan dehydraatioreaktioon, mikä vahvisti glysiinin sisältymisen hybridirakenteisiin.

Samankaltainen vaikutus isomeerijakaumaan havaittiin myös silloin, kun P-riboosia reagoitiin sytosiinin/guaniinin kanssa glysiinin läsnä ollessa (Kuva 4c, Täydentävät kuvat 125-140). Eri isomeerilajien (GMP, CMP, cGMP, cCMP, guanosiini ja sytidiini) maksimi-intensiteetit pienenivät, ja myös suhteellisten intensiteettien jakautuminen muuttui. Kokeiden väliset erot todennettiin tarkasti käyttämällä tilastollista menetelmää, kuten EIC-tietojen klusterianalyysia, jolla näytteet jaettiin glysiinin läsnä ollessa ja ilman glysiiniä ryhmiin/klustereihin, joilla oli yhteisiä ominaisuuksia (kuva 5). Klusterianalyysin tavoitteena tässä tutkimuksessa on ryhmitellä tiedot (eli nukleotidi- ja nukleosidirakenteen muodostuminen) osatekijäkokonaisuuksiksi, joilla on yhteisiä ominaisuuksia (esim. glysiinin lisääminen vs. ilman glysiiniä). Tämän analyysin pitäisi osoittaa suurta sisäistä homogeenisuutta klustereiden/ryhmien sisällä ja suurta ulkoista heterogeenisuutta klustereiden/ryhmien välillä. Kuvassa 5 esitetään dendrogrammi, jossa on ”Wards”-linkitys35. Klustereiden tunnistamiseksi dendrogrammissa olemme värittäneet spektrit glysiinin esiintymisen mukaan (glysiini – punainen, ei glysiiniä – musta, tyhjä – sininen). Kuten voidaan havaita, glysiiniä sisältävät näytteet ryhmittyvät yhteen. Yksi klusteri vastaa P-riboosi + adeniini + glysiiniä (kolme näytettä), joka on erotettu näytteistä, joissa ei ole glysiiniä. Toinen klusteri vastaa P-riboosi + guaniini + glysiiniä ja P-riboosi + sytosiini + glysiiniä. Adeniinia sisältävät näytteet erottuvat suuremmaksi klusteriksi, joka erottuu muista näytteistä, mikä viittaa adeniinin voimakkaaseen vaikutukseen reaktiossa. Todellakin on olemassa useita muita mahdollisia tuotteita ja reaktioita, joita voi tapahtua suoritetuissa reaktio-olosuhteissa (ks. lisätietoja täydentävästä huomautuksesta 1 ja täydentävistä kuvista 150-162).

Adeniinin dehydraatioreaktioon P-riboosin kanssa otettiin mukaan muitakin aminohappoja, jotta voitiin testata, vaikuttaisivatko myös ne jollakin tavalla glykosylaatiotuotteiden isomeeriseen jakaumaan (täydentävät kuvat 141-143). Tähän tutkimukseen valituilla kuudella aminohapolla (arginiini, glutamiinihappo, treoniini, metioniini, fenyylialaniini ja tryptofaani) on erilaiset sivuketjut, joilla on erilainen kemiallinen luonne ja erilaiset funktionaaliset ryhmät. Kun tuloksia verrattiin ainoastaan P-riboosin ja adeniinin reaktiosta saatuihin tietoihin, AMP:n isomeerijakaumassa havaittiin muutoksia kaikissa reaktioissa, paitsi tryptofaanin tapauksessa, mikä saattaa johtua tryptofaanin indolipohjaisen sivuketjun läsnäolosta johtuvista konformaatiorajoituksista. Analysoitaessa cAMP:n EIC:tä havaittiin pienempiä muutoksia isomeeristen piikkien suhteellisessa intensiteetissä. Adenosiinin EIC:ssä havaittiin kuitenkin selvä ero vain fenyylialaniinia ja treoniinia sisältävissä reaktioissa.