Nestekromatografia-massaspektrometria elintarvikeanalytiikassa

Orgaanisten hivenyhdisteiden määrittäminen elintarvikeanalytiikassa on erittäin tärkeää elintarvikkeiden laadun ja turvallisuuden kannalta. Sekä analyytin erottaminen elintarvikematriisin mahdollisista epäpuhtauksista että kohdeyhdisteen kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen määritys ovat elintärkeitä vaiheita analyyttisessä elintarvikekemiassa.

Määritelmä

Nestekromatografia (Liquid Chromatography, tässä High Performance LC – HPLC) on fysikaalinen erotustekniikka hivenaineanalyyseissä. Se perustuu analyytin vuorovaikutukseen stationäärifaasin (hiukkasilla varustettu kolonni) ja liikkuvan faasin (nestemäinen eluentti tai eluenttien seos) kanssa. Massaspektrometria (MS) on analyysiväline, jolla mitataan näytteen koostumus. MS tuottaa hyödyllistä tietoa analyyttien molekyylipainosta ja rakenteesta ja auttaa tuntemattomien yhdisteiden selvittämisessä.

Yhdistelmä, LC/MS, LC-MS on tehokas tekniikka, koska sen herkkyys (jopa ppt-alueella) ja spesifisyys ovat erittäin suuria. Orgaanisen hivenaineanalytiikan alalla MS:ää käytetään moniin sovelluksiin, mutta toisin kuin GC/MS (kaasukromatografia yhdistettynä massaspektrometriaan), se on tarkoitettu sellaisten näytteiden analysointiin, jotka sisältävät haihtumattomia analyyttisiä kohteita, joiden massa on tyypillisesti 200 – 800u, jotka ovat termisesti labiileja, erittäin poolisia tai joiden molekyylimassa on suuri.

Työperiaate

Periaatteessa LC/MS-laitteen on suoritettava neljä työvaihetta, mukaan lukien:

1. Alyyttien kromatografinen erottaminen erotuskolonnilla
2. Alyytin ionisointi
3. Ionien eristäminen ja
4. Ionien tunnistaminen

Yleisesti ottaen ei ole triviaalia liittää HPLC-järjestelmää ja massaspektrometriä toisiinsa, sillä vaikeutena on liuenneen aineen muuttaminen kaasufaasi-ioniksi. Haasteena on päästä eroon liuottimesta säilyttäen samalla riittävä tyhjiötaso massaspektrometrissä ja tuottaa kaasufaasi-ionit. Siksi kromatografiakolonnista eluoituvat komponentit johdetaan massaspektrometriin erikoistuneen rajapinnan kautta.

Kaksi yleisimmin käytettyä ionisaatiorajapintajärjestelmää, kemiallinen ionisaatio ilmakehän paineessa (APCI) ja sähkösuihku-ionisaatio (ESI), valitaan analyyttien fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien (esim. polaarisuus ja happamuus) mukaan. Ionisaatio tapahtuu ilmanpaineessa, ja molempia pidetään pehmeänä ionisaatiomenetelmänä, eli massaspektristä saadaan lähinnä molekyylipainotietoa, ellei käytetä fragmentointitekniikoita.

Koska yhdisteet osittain liukenevat yhdessä kromatografisesta systeemistä, yksittäisten fragmenttien selkeä määrittäminen ei onnistu pelkällä LC-MS:llä, jossa on käytettävissä vain molekyyli-ionien massat. Tämän ongelman ratkaisemiseksi käytetään nykyään pääasiassa tandem-massaspektrometriaa (MS/MS), jossa massan valinta tai analyysi tapahtuu useassa vaiheessa (LC/MS/MS tai LC/MSn). Näillä järjestelmillä pystytään määrittämään jäämiä alemmalla ppt-alueella. Orgaanisten molekyylien määritykseen tarvitaan erilainen tekninen MS-asetus. Yksi mahdollinen lähestymistapa pätevöintiin on käyttää MS-järjestelmää, joka tuottaa ioneja, johtaa ne lineaariseen ioniloukkuun ja varastoi ne sitten radiotaajuuskenttään. Tämän jälkeen erilaiset tekniset mahdollisuudet mahdollistavat ionien ja siten tuntemattoman yhdisteen kvalifioinnin.

Sovellukset

Sen jälkeen, kun LC/MS otettiin käyttöön rutiinianalyyseissä noin kymmenen vuotta sitten, se on vakiinnuttanut asemansa useimmilla analyyttisen kemian osa-alueilla, esimerkiksi laadunvalvonnassa, perus- ja soveltavassa tutkimuksessa ja viranomaisvalvonnassa.

Seuraavat esimerkit antavat lyhyen yleiskatsauksen:

a) Farmasia

• Lääkkeiden farmakokineettiset tutkimukset, esim. lääkkeiden hajoamisprosessit
• Lääkekehitys, esim. metaboliittien tunnistaminen tai epäpuhtauksien tunnistaminen

b) Molekyylibiologia

• Proteomiikka, esim. proteiinien laajamittainen tutkimus, erityisesti niiden rakenteet ja toiminnot
• Metabolomiikka, esim.esim. aineenvaihdunnan välituotteiden, hormonien ja muiden signaalimolekyylien määrittäminen

c) Ympäristö

• Jätevesi, esim. hormonaaliset yhdisteet
• Maaperä, esim. orgaaniset metallit

d) Elintarvikkeet

• Ainesosat, esim. aminohapot, lipidit
• Saasteet, esim. Torjunta-aineiden, äyriäismyrkkyjen, eläinlääkejäämien monijäämäanalyysi, väriaineiden, akryyliamidin määritys, mikrokystiinien analyysi
• Luonnontuotteet, esim. terpeenit, steroidit

Perfluoratut tensidit (PFC) esimerkkinä elintarvikeanalytiikassa

Tausta

PFC on erinomainen esimerkki siitä, miten monimutkainen näytteenvalmistus voidaan yhdistää kehittyneisiin LC/MS-laitteisiin ja syvälliseen tietämykseen analyyttisestä kemiasta. PFT:n ainutlaatuisten ominaisuuksien ansiosta niitä voidaan käyttää useissa teollisissa ja kaupallisissa tuotteissa, kuten jäähdytysnesteissä, polymeereissä sekä lääkkeiden ja torjunta-aineiden komponentteina. Erityisesti perfluorattuja karboksylaatteja (esim. PFOA – perfluorioktaanihappo) ja perfluorattuja sulfonaatteja (esim. PFOS – perfluorioktaanisulfonihappo) käytetään pinta-aktiivisina aineina esimerkiksi tekstiilien ja mattojen kyllästämiseen, palonsammutusvaahdoissa ja paperiteollisuudessa rasvanestokäsittelyssä. PFC:tä on tuotettu yli 50 vuotta, ja sitä levitetään nykyään maailmanlaajuisesti. Jos C-H-sidoksia ei ole täysin korvattu C-F-sidoksilla, joka on yksi vahvimmista tunnetuista kemiallisista sidoksista, hajoaminen on edelleen mahdollista.

Toksikologisesti on arvioitu vain PFOA:ta ja PFOS:ää (kroonisesti myrkyllisiä ja syöpää aiheuttavia), kaikkia muita homologisia yhdisteitä, isomeerejä jne. ei ole vielä arvioitu. Fysikaalisesta näkökulmasta PFC:t ovat sekä pysyviä (eli hajoamattomia) että liikkuvia (eli voivat huuhtoutua saastuneesta maaperästä pohjaveteen). Tämä on pysyvä uhka juomaveden ottamisen ja/tai valmistuksen yhteydessä. Lisäksi nämä yhdisteet kulkeutuvat kasvien välityksellä ravintoketjuun.

Kahdessa saksalaisessa joessa vuonna 2006 havaitut korkeat PFC-saasteet herättivät yleistä kiinnostusta näitä yhdisteitä kohtaan.

Vuoden 2006 pilaantuminen saattoi olla peräisin orgaanisesta lietteestä, jota käytettiin lannoitteena maataloudessa. Osoittautui, että maaperä sisältää jopa 600 µg PFC:tä/kg, mikä aiheutti juomaveden ja vesihuoltolaitosten saastumista. Tähän mennessä seitsemän Saksan osavaltiota on ilmoittanut PFC-kontaminaatiosta.

Fraunhofer IME

Fraunhofer IME

Molekyylibiologian ja soveltavan ekologian Fraunhofer-instituutin keskeisiä osaamisalueita on kehittää toteuttamiskelpoisia ja luotettavia menetelmiä kemiallisten epäpuhtauksien tunnistamiseksi ja analysoimiseksi elintarvike- ja ympäristömateriaaleista.

Fraunhofer IME on vuodesta 1999 lähtien toteuttanut hankkeita, joiden tarkoituksena on ollut mitata FKY-kontaminaatioita erilaisissa ympäristömatriiseissa. Työ on tehty teollisuuskumppaneiden toimeksiannosta, ja siinä on keskitytty erityisesti PFC-karboksylaatteihin ja PFC-sulfonaatteihin. Lisätutkimuksia tehtiin Saksan liittovaltion ympäristönäytepankin seurantaohjelman toimeksiannosta, ja niihin sisältyi myös ihmisverinäytteitä. Vuonna 2005 tehtiin ensimmäiset elintarvikkeita koskevat tutkimukset, ja vuonna 2006 tiedotusvälineissä käsiteltiin myös valikoiduista elintarvikenäytteistä (esim. äidinmaidosta ja ranskalaisista perunoista) saatuja tuloksia. Vuonna 2007 toteutettiin laajempia hankkeita, joissa keskityttiin kasvinsiirtoon, perunaan ja tuotteisiin, ihmismatriiseihin (veri ja rintamaito) sekä ympäristönäytteisiin (esim. jätevesi, liete ja maaperä).

Analyyttinen ratkaisu

Kolmea erilaista näytevalmistetta käytettiin kaikkien mahdollisten näytematriisien kattamiseksi:

• IPE (Ionipariextraktio). Ionipariaineen tetra-n-butyyliammoniumhydrogensulfaatin käyttö, jota seuraa nestemäinen kiinteä uutto (esim. ympäristönäytteet)
• AAE (happoemäksinen uutto). Lipidien poisto heksaanilla pH:ssa 14 (nestemäinen ammoniakkiliuos), pH:n säätäminen suolahapolla pH:een 1 ja uuttaminen tert-butyylimetyylieetterillä (esim. rintamaito)
• SPE (kiinteän faasin uuttaminen, tällä hetkellä eniten mainittu menetelmä), jossa käytetään patruunoita, joiden polariteetti on erilainen PFC:n ionisen luonteen mukaan puskuroidussa väliaineessa (esim.esim. peruna)

Sisäisten standardien käyttö kalibrointiin on erittäin suositeltavaa; tällä hetkellä menetelmissämme on yhdeksän massamerkittyä PFC-standardia. Ennen näytteiden syöttämistä LC/MS-laitteeseen itse laite on tarkistettava teflonpäällysteisten varaosien varalta, koska ne sisältävät emittoivaa PFC:tä, joka vaikuttaa tuloksiin ei-toistettavalla tavalla. Nämä osat on vaihdettava, mikä edellyttää LC/MS:n komponenttien parempaa tuntemusta.

Analyyttinen esimerkki

Raakaperunan ja perunatuotteiden analyysejä varten säädimme LC/MS/MS:n (HPLC Alliance 2695 Quattro Ultima Pt:llä Electrospray-negatiivisessa tilassa, molemmat Waters; 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2)-kolonni, Phenomenex) järjestelmää 9 perfluorikarboksyylihapon (C4 – C12) ja 3 perfluorosulfonihapon (C4, C6, C8) kohdemassoille käyttäen 13C-merkittyjä vertailumateriaaleja (LOQ 0.5 µg/Kg) SPE-näytteen valmistuksen jälkeen.

PFC-yhdisteet jakautuivat eri tavoin raa’assa perunassa ja perunatuotteissa (taulukko 1), mikä antaa mahdollisuuden olettaa kontaminaation tapahtuneen jalostuksen aikana sekä maaperän kontaminaation. Tätä voidaan tukea vuonna 2006 tehdyistä PFC-perunoita koskevista tutkimuksistamme, joissa analysoimme pikaruokaravintoloista peräisin olevia ranskalaisia perunoita ja löysimme jopa 2,8 µg PFOA:ta/kg ja jopa 0,9 µg PFOS:ää/kg.

Analyyttiset tulevaisuudennäkymät

Fraunhoferin IME:llä on merkittävää asiantuntemusta ja kokemusta PFC:n analysoinnista, jota voitaisiin soveltaa monilla ympäristöön/elintarvikkeisiin liittyvän PFC-saastuneisuuden osa-alueilla, jotka ovat vielä vailla tutkimuksia. Monet lyhyt- ja pitkäketjuiset PFC:t sisältyvät jo tutkimusohjelmaamme, mutta analyysivalmiuksiamme voitaisiin parantaa ottamalla mukaan uusia PFC:itä. Lisätyt PFC:t on tunnistettava LC/MS:llä, koska kaupallisia standardeja ei ole saatavilla. Tämä johtaa konsolidoituihin havaintoihin lähtöaineista, elintarvikkeiden kontaminaatioreiteistä ja hajoamisesta elintarvikkeiden käsittelyn aikana.