MTT, keltainen tetratsoli, pelkistyy elävissä soluissa violetiksi formazaaniksi. Liuotusliuosta (yleensä joko dimetyylisulfoksidia, hapatettua etanoliliuosta tai detergentin natriumdodekyylisulfaatin liuosta laimennettuun suolahappoon) lisätään liukenemattoman violetin formazaanituotteen liuottamiseksi värilliseksi liuokseksi. Tämän värillisen liuoksen absorbanssi voidaan kvantifioida mittaamalla spektrofotometrillä tietyllä aallonpituudella (yleensä välillä 500-600 nm). Valon absorptioaste on riippuvainen solun sisälle ja solun pinnalle kertyneen formazaanipitoisuuden asteesta. Mitä suurempi formazaanikonsentraatio on, sitä voimakkaampi on violetti väri ja sitä suurempi on absorbanssi.

XTT (2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli)-2H-tetratsolium-5-karboksanilidi) on ehdotettu MTT:n korvaajaksi, sillä se on herkempi ja dynaamisempi. Muodostunut formazaaniväriaine on vesiliukoinen, jolloin vältytään lopulliselta liuottamisvaiheelta.

Vesiliukoiset tetratsolisuolat ovat uudempia vaihtoehtoja MTT:lle: ne on kehitetty tuomalla positiivisia tai negatiivisia varauksia ja hydroksiryhmiä tetratsolisuolan fenyylirenkaaseen tai paremminkin lisäämällä sulfonaattiryhmiä suoraan tai epäsuorasti fenyylirenkaaseen.

MTS (3-(4,5-dimetyylitatsoli-2-yyli)-5-(3-karboksimetoksifenyyli)-2-(4-sulfofenyyli)-2H-tetratsolium) tuottaa fenatsiinimetosulfaatin (PMS) läsnäollessa formazaanituotteen, jonka absorbanssimaksimi on 490 nm:ssä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. MTS-määritystä kuvataan usein ”yksivaiheiseksi” MTT-määritykseksi, jonka ansiosta reagenssi voidaan lisätä suoraan soluviljelmään ilman MTT-määrityksessä tarvittavia välivaiheita. Tämä mukavuus tekee MTS-määrityksestä kuitenkin alttiin värimittaushäiriöille, koska MTT-määrityksen välivaiheet poistavat värillisten yhdisteiden jäämiä, kun taas ne jäävät mikrotiitterilevyyn yksivaiheisessa MTS-määrityksessä. Tätä määritystä käytettäessä on noudatettava varovaisuutta tarkkuuden varmistamiseksi, ja MTS-tulosten vahvistaminen mikroskoopilla tehtävillä kvalitatiivisilla havainnoilla on perusteltua. (Tämä on kuitenkin varovaisuusperiaatteen mukaista kaikkien kolorimetristen määritysten osalta.)

WST:t (vesiliukoiset tetratsoliumsuolat) ovat sarja muita MTT-määrityksissä käytettäviä vesiliukoisia väriaineita, jotka on kehitetty antamaan erilaisia absorptiospektrejä muodostuneille formazaaneille. WST-1 ja erityisesti WST-8 (2-(2-metoksi-4-nitrofenyyli)-3-(4-nitrofenyyli)-5-(2,4-disulfofenyyli)-2H-tetratsolium) ovat MTT:hen verrattuna edullisia siinä mielessä, että ne pelkistyvät solujen ulkopuolella, yhdistyvät PMS-elektroninvälittäjään ja tuottavat vesiliukoisen formazaanin. Lopuksi WST-määritykset (1) voidaan lukea suoraan (toisin kuin MTT, joka tarvitsee liuotusvaiheen), (2) antavat tehokkaamman signaalin kuin MTT ja (3) vähentävät myrkyllisyyttä soluille (toisin kuin soluja läpäisevä MTT ja sen liukenematon formazaani, joka kerääntyy solujen sisälle).

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.