Immunovärjäyksessä käytetään vasta-aineita antigeenin havaitsemiseen soluissa tai kudoksissa. Immunovärjäyksen suurin hyöty immunohistokemiassa (IHC) on kyky nähdä haluttu kohde kudosnäytteessä säilyttäen samalla tilallisen kontekstin ja kudosarkkitehtuurin.
Immunohistokemia (IHC) värjäys: Lyhyt määritelmä
Värjäystyypit
Immunovärjäys voidaan suorittaa joko suoraan tai epäsuorasti. Suora merkintä on mahdollista konjugoimalla sovellusvalidoituja vasta-aineitamme useisiin fluorofooreihin. Voit selata suorien konjugaattien tarjontaamme klikkaamalla tästä.
Usein antigeenin ilmentymistason ja saavutettavuuden perusteella suora konjugaatti ei riitä kiinnostavan kohteen visualisointiin. Näissä tapauksissa käytetään epäsuoraa merkintää sekundäärisellä vasta-aineella. CST:ssä käytetään mieluiten erittäin herkkiä, yksivaiheisia, polymeeripohjaisia detektioreagensseja, jotka ovat spesifisiä kanin tai hiiren IgG:lle.
Esimerkkejä IHC-värjäyksistä
Alhaalla on esimerkkejä CST:ssä tehdyistä IHC-värjäyksistä. Jokainen alla käytetyistä vasta-aineista on läpäissyt tiukan validointiprosessimme, jotta voimme varmuudella arvioida halutun antigeenin spesifisen havaitsemisen.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen keuhkokarsinoomasta PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb:llä.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen keuhkokarsinoomasta käyttäen PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb:tä.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: IHC-analyysi parafiiniin upotetusta ihmisen rintasyövästä käyttäen CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen rintasyövästä käyttäen CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen endometrioideaalisesta karsinoomasta käyttäen α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb:tä, joka on suoritettu Leica® Bond™ Rx:llä.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen endometrioidisesta karsinoomasta käyttäen α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb:tä, joka on suoritettu Leica® Bond™ Rx:llä.
Miten immunohistokemiallinen (IHC) värjäys tehdään?
Kudosten valmistelu
Kudosten keräys-, säilytys- ja fiksaatiomenetelmät vaihtelevat näytteestä tai kiinnostuksen kohteesta riippuen. Kudoksen kerääminen ja fiksaatio vaikuttavat suoraan näytteen eheyteen ja kokeellisiin tuloksiisi.
Ristisilloittavia fiksatiiveja, kuten formaliinia, käytetään usein näytteiden valmisteluun IHC:tä varten, koska ne säilyttävät kudoksen rakenteellisen eheyden, mikä auttaa säilyttämään kudosarkkitehtuurin. Toinen vaihtoehto on kryosäilyttää (pakastaa) näytteet, mikä voi olla parempi vaihtoehto, jos yrität havaita fosforyloidun kohteen.
Antigeenin (epitoopin) löytäminen
Kudosnäytteen rakenteellisen eheyden säilyttämiseen käytettävillä fiksatiiveilla on myös se haittapuoli, että ne saattavat peittää epitoopin, jonka vasta-aineesi on suunniteltu tunnistamaan.
Fiksaatiossa peittyneiden epitooppien paljastamiseksi on olemassa useita menetelmiä. Näitä ovat esimerkiksi proteolyyttinen antigeenin talteenotto, joka perustuu proteinaasi K:n kaltaiseen entsyymiin, tai lämpöindusoitu epitooppien talteenotto (HIER), jossa käytetään lämpöä ristisilloittuneiden sidosten hajottamiseen ja proteiinien purkamiseen. Kummallakin menetelmällä voidaan irrottaa epitoopit, jolloin primaarivasta-aine pääsee niihin käsiksi ja ne voidaan värjätä IHC:llä.
CST:ssä yleisin antigeenin talteenottomenetelmämme on HIER. Tutkijamme kuitenkin testaavat useita antigeenin talteenottomenetelmiä määrittääkseen optimaaliset olosuhteet kunkin vasta-aineen käytölle IHC:ssä. CST:n suosittelema protokolla löytyy jokaisen IHC-validoidun vasta-aineen tietolehdestä.
Vasta-aineen sitoutuminen
Oikean vasta-aineen valinta on yksi kriittisimmistä vaiheista onnistuneen IHC-tuloksen saamiseksi. Kaikille CST:n IHC-validoiduille vasta-aineille on varmistettu paitsi vahva signaali kudoksessa, myös tiukka validointimenettely signaalin spesifisyyden varmistamiseksi. IHC:hen erikoistuneet tutkijamme testaavat suuren määrän vasta-aineita ja suosittelevat vain niitä, jotka soveltuvat parhaiten sovellukseen.
Klikkaa tästä selataksesi IHC-validoituja vasta-aineita kohdettasi varten.
Näytteenottojärjestelmät
Immunohistokemia (IHC) -värjäykset mahdollistavat 2 laajaa osoitusluokkaa: 1) kromogeeninen ja 2) fluoresoiva. Kromogeeniseen osoittamiseen CST suosittelee polymeeripohjaisia järjestelmiä, joilla vältetään biotiinipohjaisen järjestelmän rajoitukset ja lisätään samalla määrityksen herkkyyttä.
Kokeile SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, kani) #8114 tai SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, hiiri) #8125 riippuen primäärivasta-aineesi isäntälajista.
Polymeeripohjainen detektio on herkempi kuin biotiinipohjainen järjestelmä. IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen keuhkokarsinoomasta käyttäen Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 ja joko biotiinipohjaista detektiota (vasen) tai polymeeripohjaista detektiota (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; oikea). Kuten näkyy, polymeeripohjainen detektointi tarjoaa paremman herkkyyden ja johtaa kestävämpään värjäytymiseen.
Polymeeripohjainen detektointi on herkempi kuin biotiinipohjaiset järjestelmät. IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen keuhkokarsinoomasta käyttäen Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 ja joko biotiinipohjaista detektiota (vasemmalla) tai polymeeripohjaista detektiota (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; oikealla). Kuten näkyy, polymeeripohjainen toteaminen tarjoaa paremman herkkyyden ja johtaa kestävämpään värjäytymiseen.
Kaikki DAB-substraatit eivät toimi yhtä hyvin. IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen rintasyövästä käyttäen Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. Kromogeeninen toteaminen suoritettiin käyttämällä SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (vasemmalla), kilpailijan 1 toimittamaa DAB:tä (keskellä) tai kilpailijan 2 toimittamaa DAB:tä (oikealla). Vaikka kilpailija 2:n DAB tuottaa signaalin, joka on verrattavissa SignalStain® DAB Substrate Kitiin, kilpailija 1:n DAB tuottaa paljon heikomman signaalin.
Kaikki DAB-substraatit eivät toimi yhtä hyvin. IHC-analyysi parafiiniin sulautetusta ihmisen rintasyövästä käyttäen Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. Kromogeeninen toteaminen suoritettiin käyttämällä SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (vasemmalla), kilpailijan 1 toimittamaa DAB:tä (keskellä) tai kilpailijan 2 toimittamaa DAB:tä (oikealla). Vaikka kilpailija 2:n DAB tuottaa SignalStain® DAB Substrate Kitiin verrattavissa olevan signaalin, kilpailija 1:n DAB tuottaa paljon heikomman signaalin.
Vastavärjäys
Vasta-aineen havaitsemisen jälkeen monet tutkijat haluavat mieluummin vastavärjätä kudoksen, jotta voidaan havainnollistaa solujen anatomia ja suunnata katsojaa suhteessa spesifiseen värjäykseen. CST:ssä käytämme näytteissämme vastavärjäystä Hematoxylin #14166:lla, joka värjää ytimen siniseksi. Vastavärjäystä valittaessa on tärkeää, että vastavärjäys on yhteensopiva kromogeenisi kanssa. Jos esimerkiksi vasta-aineen väri on liian samanlainen kuin kromogeenin väri, vasta-aineen signaalia on vaikea tunnistaa.
Immunohistokemian (IHC) värjäysprotokolla
Alhaalla on yleiskatsaus suosittelemaamme protokollaan, ja siinä on korostettu tärkeimpiä vaiheita onnistuneeseen kokeeseen. CST pyrkii auttamaan sinua parantamaan IHC-analyysejäsi tarjoamalla validoituja vasta-aineita ja reagensseja, joiden avulla voit noudattaa yksinkertaista, tuotekohtaista protokollaa ja saada toistettavissa olevia tuloksia mahdollisimman vähäisellä optimointitarpeella.
Katso IHC-protokollavideo tai käy protokollan valintasivullamme.