GFP
Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP, Green Fluorescent Protein) on meduusa Aequorea victoria -lajin meduusasta löydetty 238 aminohappoa sisältävä yhden polypeptidin geenituote. Proteiinilla on luonnollinen vihreä fluoresenssi tietyissä valaistusolosuhteissa. Proteiini saa bioluminesenssinsa Ser-Tyr-Gly-syklisoitumisesta sen ensisijaisessa aminohapposekvenssissä. GFP on melko stabiili ja kestää useita kemiallisia käsittelyjä ja menetelmiä.1 Ensimmäinen osoitus siitä, että tätä fluoresoivaa proteiinia voitiin ilmentää heterologisessa järjestelmässä, tehtiin C. elegansissa.2 GFP:stä on sittemmin tullut suosittu reportterigeeni, koska se ei vaadi biokemiallista transformaatiota, kontrastiainetta tai haitallista ionisoivaa säteilyä tullakseen näkyväksi.3 Tämän ensimmäisen raportin jälkeen GFP-reportterigeenin ilmentymisestä on raportoitu useissa organismeissa, myös hiirissä.4 Lisäksi siirtogeeniset GFP-hiiret voivat tietyn promoottorin ohjaamina ilmentää fluoresoivaa proteiinia kudos- ja jopa solukohtaisesti. Ei-invasiivinen visualisointi on avainasemassa, kun halutaan seurata fysiologisia ja biokemiallisia prosesseja in vivo ja reaaliajassa.5
GFP:n bioluminesenssin visualisoimiseksi on lukuisia tapoja. Yksi tapa havaita fluoresenssi on käsikäyttöinen UV-valo (365 nM). Fisher tarjoaa useita malleja, joiden hintaluokka on noin 100-200 dollaria. Kädessä pidettävän UV-valon menetelmä ei toimi kovin hyvin GFPX-siirtogeeniselle kannalle (kanta 003116). Tohtori Andras Nagy, GFPX- ja GFPU-siirtogeenien (varastot 003115 ja 003116) lahjoittajatutkija, kuvailee katselupäätä ja mikroskooppiin sovitettavaa suodatinta, joita on nyt saatavilla kaupallisesti.
CFP ja YFP
Viimeaikaiset edistysaskeleet ovat parantaneet GFP:n ominaispiirteitä ja käyttökelpoisuutta reportterigeeninä. Tehostettua GFP:tä (EGFP) on kehitetty siten, että se ilmentyy nisäkässoluissa korkeammalla tasolla ja fluoresoi voimakkaammin. Cyan Fluorescent Protein (CFP) ja Yellow Fluorescent Protein (YFP) ovat GFP:n spektrisiä muunnoksia, joiden avulla voidaan merkitä useita solutyyppejä samanaikaisesti.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Vihreästi fluoresoivien proteiinien ymmärtäminen, parantaminen ja käyttö. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Vihreä fluoresoiva proteiini geeniekspression merkkiaineena. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Vihreän fluoresoivan proteiinin kuvantaminen kasvainsoluista hiirissä. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. ”Vihreät hiiret” kaikkialla esiintyvien vihreiden solujen lähteenä. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Vihreää fluoresoivaa proteiinia ilmentävien kasvainten ja etäpesäkkeiden koko kehon optinen kuvantaminen. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Reportaattorigeenin avulla voidaan tutkia tietyn promoottorin geeniekspression spatiaalisia malleja kudoksessa, alkiossa tai aikuisessa hiiressä.1 E. coli lacZ-geeniä, kun se integroidaan hiiren genomiin siirtogeenitekniikoiden avulla, voidaan käyttää reportterigeeninä tietyn promoottorin/tehostajan valvonnassa siirtogeenin ekspressiointikasetissa. LacZ-geeni koodaa beta-galaktosidaasia, joka katalysoi laktoosin pilkkomista galaktoosiksi ja glukoosiksi. Beetagalaktosidaasiaktiivisuus voidaan tunnistaa sekä in situ että in vitro -tekniikoilla, kun sitä inkuboidaan beetagalaktosidaasin substraatin X-galin kanssa. Beetagalaktosidaasi pilkkoo kromogeenistä substraattia X-galia, jolloin syntyy liukenematonta sinistä väriainetta, mikä mahdollistaa niiden solujen tunnistamisen, joilla on lacZ-aktiivisuutta.2 Siirrännäiseläimiä voidaan käyttää sellaisten tekijöiden ja olosuhteiden yksilöimiseen, jotka muokkaavat promoottorin tai tehostajan ilmentymisprofiilia.