Genomin sekvensointi ja vertailu kahdesta kädellisten eläinmallista, cynomolgus- ja kiinalaisesta rhesusmakakista

Makakit ovat kädellisistä kädellisistä laajimmalle levinnyt, ja ne koostuvat yli 20 lajista, jotka erosivat toisistaan jopa 5-6 miljoonaa vuotta sitten2. Makakoiden suku on läheistä sukua ihmiselle, sillä niillä on viimeinen yhteinen esi-isä ∼25 miljoonaa vuotta sitten3. Ihmisten ja makakoiden läheinen sukulaisuus on tehnyt useista lajeista houkuttelevia eläinmalleja erilaisiin biolääketieteellisiin analyyseihin. Vaikka rhesusmakakki (Macaca mulatta mulatta) Intian alalaji (Macaca mulatta mulatta) oli alun perin ensisijainen tutkimusmalli, tämän makakin vientikielto on vähentänyt huomattavasti näiden eläinten saatavuutta, mikä on johtanut muiden makakkilajien ja/tai -alalajien, erityisesti kiinanrhesusmakakin (Macaca mulatta lasiota) ja cynomolgus- tai rapusyöjämakakin (Macaca fascicularis) käytön lisääntymiseen.

Sekvensoimme naaraspuolisen CR-makakin ja naaraspuolisen CE-makakin genomit käyttäen koko genomin shotgun-strategiaa seuraavan sukupolven sekvensointialustalla. Lyhyesti mitokondriogenomin sekvenssianalyysi vahvisti molempien yksilöiden ennustetun alkuperän (Täydentävä jakso 1). Tämän jälkeen rakensimme 19 ja 18 moninkertaista parittaista genomista DNA-kirjastoa, joiden inserttien koko kasvoi asteittain CR- ja CE-makakin osalta. Kootun CR- ja CE-makakin genomin kokonaiskoko oli ∼2,84 Gb ja 2,85 Gb, mikä vastaa keskimäärin 47-kertaista ja 54-kertaista kattavuutta (taulukko 1 ja täydentävä jakso 1). Scaffoldit osoitettiin kromosomeihin Intian rhesusmakakin4 ja ihmisen genomisekvenssien kanssa ilmenevän syntenian mukaisesti. Noin 97 prosenttia CR-makakki-telineistä ja 92 prosenttia CE-makakki-telineistä voitiin sijoittaa kromosomeihin. Sovelsimme myös RNA-seq-menetelmää profiloidaksemme transkriptejä eri kudoksissa yhdestä IR- ja kahdesta CE-makakista (Online-menetelmät). Tämän jälkeen käytettiin genomi- ja transkriptomitietoja yhdistävää integroitua analyysia transkriptien rakenteen määrittelemiseksi ja kunkin geenin ilmentymisprofiilin selvittämiseksi (Täydentävä jakso 2).

Makakujen geneettistä diversiteettiä arvioitiin vertailemalla kokonaisia genomeja toisiinsa ja tekemällä lyhyitä lukukokoisuuksia (short read alignment), joissa käytettiin referenssiluvun pohjana IR-makakun genomia. Kaikkiaan havaitsimme >20 miljoonaa yhden nukleotidin eroa ja 740 827 indel-tapahtumaa kolmessa makakkilajissa tai -alalajissa (täydentävä jakso 3), mikä tarjoaa runsaasti geneettistä heterogeenisuutta käytettäväksi tulevissa biolääketieteellisissä sovelluksissa ja analyyseissä. Luokittelimme kaikki yhden nukleotidin vaihtelevat kohdat kolmeen luokkaan (jaetut, kiinteät ja ainutlaatuiset variantit) sen perusteella, onko niitä esiintynyt vai ei kolmessa yksilössä (kuva 1a). Ainutlaatuiset variantit muodostivat >71,7 % kaikista varianteista, mikä ei ole yllättävää, kun otetaan huomioon, että jopa panmiktiivisessa populaatiossa 44 % alleeleista odotetaan olevan singletoneja kolmen yksilön näytteessä. On huomionarvoista, että suuri osa geneettisistä eroista oli yhteisiä ainakin kahden makakin välillä. Käyttämällä vain kiinteitä ja yksilöllisiä variaatioita arvioimme, että suurin eroavuusaste, 0,40 prosenttia, oli CE- ja IR-makakin välillä (kuva 1b). CE- ja CR-makakin (0,34 %) välinen sekvenssidiversenssi, vaikka ne ovatkin nimellisesti eri lajeja, oli kuitenkin lähellä sitä, joka havaittiin alalajien, CR-makakin ja IR-makakin, välillä (0,31 %).

Rajallisiin sekvenssiaineistoihin perustuvissa viimeaikaisissa tutkimuksissa on ehdotettu, että muinainen introgressio on saattanut tapahtua CR-makakista CE-makakkeihin, jotka elävät päällekkäisellä maantieteellisellä levinneisyysvyöhykkeellä Intian ja Kiinan välisellä niemenkärjellä5,6,7. Kahden sekvensoidun genomin avulla pystyimme määrittämään tämän introgression vaikutuksen koko genomin tasolla. Tarkemmin sanottuna tutkimme, oliko CR- ja CE-makakin genomissa havaittavissa lajien väliseen hybridisaatioon viittaavaa DNA-signaalia. Laskimme CE- ja CR-makakin välisen eroavaisuussuhteen ja vertasimme sitä CR- ja IR-makakin väliseen eroavaisuussuhteeseen 50 kilotavun ikkunoiden osalta linjatuissa genomeissa (täydentävä jakso 4). Näissä laskelmissa jätimme huomiotta CpG-kohtien vaihtelut, koska niiden tiedetään kehittyvän erityisen nopeasti. Yli 27 prosentissa ikkunoista eroavaisuussuhde oli pienempi kuin nolla, mikä viittaa siihen, että CE- ja CR-makakit ovat näillä alueilla läheisempää sukua kuin alalajit CR- ja IR-makakit (täydentävä jakso 4). Lisäksi >93 %:ssa 50 kilotavun genomi-ikkunoista eroavuusaste oli pienempi CE- ja CR-makakkojen välillä verrattuna CE- ja IR-makakkeihin. Näin ollen lajittelemattomat esivanhempien polymorfismit eivät voineet täysin selittää CE- ja CR-makakin välillä havaittujen epäjohdonmukaisten alueiden suurta osuutta. Lisäksi yhdistämällä aiemmat yksittäisten nukleotidien polymorfismia (SNP) koskevat tiedot IR- ja CR-makakkipopulaatioista sekä tiedot omista sekvensoiduista CR- ja CE-makakkiyksilöistämme8 havaitsimme, että CE-makakkiyksilömme klusteroitui CR-makakkipopulaatioon (täydentävä jakso 4). Tämä tukee vahvan geenivirran esiintymistä CR:n ja CE:n makakkien genomista. Seulomalla CE- ja CR-makakin sekä CE- ja IR-makakin välisen eroavuuden epäsymmetria-astetta arvioimme, että ∼30 % CE-makakin genomista on CR-makakin alkuperää (Täydentävä jakso 4).

Seuraavaksi pyrimme tunnistamaan CE-makakin genomista sellaisia oletettuja introgressioalueita (PIR), jotka ovat voineet olla geenivirran myötävaikutuksella. Käytimme kontrollina simuloituja tietoja (neutraalin ei-migraatiomallin mukaisesti) (Online Methods ja Supplementary Section 4) ja tunnistimme 8 942 PIR-aluetta, jotka ulottuvat 778 Mb:n alueelle ja joiden eroavaisuusaste CE- ja CR-makakkiheimojen välillä oli huomattavasti odotettua alhaisempi (Kuva 2a,b). Päällekkäisten PIR:ien yhdistämisen jälkeen havaitsimme, että useimmat PIR:t (>98 %) olivat lyhyempiä kuin 500 kb. Koska PIR:ien pituusjakauma riippuu geenivirran tapahtumisesta kuluneesta ajasta9 , lyhyiden PIR:ien yleisyys viittaa siihen, että geenivirta on tapahtunut pidemmän evoluutioajan kuluessa ja että se ei todennäköisesti ole ollut vain seurausta hyvin tuoreesta ihmisen välittämästä geenivirrasta. Havaitsimme myös merkittävän eron X-kromosomien ja autosomaalisten kromosomien välisessä vaihtelussa (täydentävä jakso 4), mikä on voinut olla seurausta urospuolisesta geenivirrasta. Yksi todennäköinen tekijä, joka on vaikuttanut rajoitettuun geenivirtaan CR-makakinaaraiden ja CE-makakkiurosten välillä, on se, että CR-makakinaarailla on selvä munasarjojen kausivaihtelu ja että ne parittelevat vain ovulaation aikana, kun taas CE-makakinaarailla ei ole selvää lisääntymiskausivaihtelua, vaan ne pysyvät seksuaalisesti vastaanottavaisina ympäri vuoden10. Kun lisäksi otetaan huomioon, että levittäytyminen on makakkeilla ensisijaisesti urospuolisten harjoittamaa naaraiden filopatrian vuoksi, tämä voisi myös selittää geenivirran CR-makakkiuroksilta CE-makakkiuroksille ja päinvastaisen geenivirran puuttumisen. Nämä populaatiot voivat siksi olla kiinnostavia eri lajien välisen lisääntymisen fysiologisten ja käyttäytymiseen liittyvien näkökohtien tutkimisessa.

Voimakas valinta uusien edullisten alleelien hyväksi johtaa ”valikoivaan pyyhkäisyyn”, joka vähentää geneettistä monimuotoisuutta suhteessa valikoimattomiin alueisiin. Kehitimme algoritmin tunnistamaan oletetut pyyhkäisyalueet, jotka sisältävät vähentynyttä variaatiota kolmen makasiinilajin/alalajin välillä, ja tuotimme simuloitua dataa neutraalin mallin olettamuksella arvioidaksemme sen tilastollista merkitsevyyttä (Online-menetelmät ja täydentävä jakso 5). Tunnistimme 217 vahvaa valikoivaa pyyhkäisyaluetta, joilla esiintyi vähennettyä vaihtelua makakoiden välillä ja jotka poikkesivat huomattavasti neutraalista odotuksesta (kuva 2c, täydentävä jakso 5 ja täydentävä taulukko 17). Huomionarvoista on, että yksi kymmenestä suurimmasta valikoivasta pyyhkäisyalueesta, joka sijaitsee makakin kromosomissa 14, sisältää vain yhden geenin, SET-sitoutumistekijä 2:n (SBF2) (kuva 2c). Näin ollen on todennäköistä, että tämä geeni, joka koodaa proteiini-tyrosiini-fosfataasiperheeseen kuuluvaa perifeeristä kalvoproteiinia, oli positiivisen valinnan kohteena makakoiden varhaisen evoluution aikana. Mahdollisesti biolääketieteellisesti kiinnostavaa on, että ihmisen SBF2:n ortologin viat aiheuttavat Charcot-Marie-Toothin taudin autosomaalisesti resessiivisen demyelinoivan muodon (CMT4B2).

Potentiaalisten positiivisen valinnan kohteiden paljastamiseksi kussakin makakki-haarassa määrittelimme 14 978 geenin 1:1 ortologit ihmiselle, simpanssille ja kolmelle makakki-lajeille/-alalajeille genomikohdistamisen avulla (Täydentävä luku 6). Makakoiden ortologikolmikoiden vertailu osoitti, että niillä on erittäin suuri nukleotidisekvenssien samankaltaisuus geenialueilla. On huomionarvoista, että 20,7 prosentilla ortologeista on suurempi samankaltaisuus CR- ja CE-makakin välillä kuin CR- ja IR-makakin välillä, mikä voi viitata introgression vaikutukseen. Geenien ontologiaan perustuva geeniluokkien vertailu makaka-, hominidi- ja muridi-linjojen välillä osoitti, että mikrotubuluspohjaiset prosessit ja insuliinireseptorin signaalireitti kehittyivät erityisen nopeasti makaka-linjassa (täydentävä jakso 6). Haarautumispaikkamalliin perustuvat todennäköisyyssuhdetestit paljastivat 16 positiivisesti valikoitunutta geeniä erityisesti IR-makakki-haarassa, 7 CR-makakki-haarassa ja 13 CE-makakki-haarassa (Täydentävä jakso 6). On kiehtovaa, että makakoiden 36 positiivisesti valitusta geenistä 31 koodaa sitovia proteiineja, joilla on merkittävä rooli geeniekspression säätelyssä. On myös syytä huomata, että kaksi dendriittiproteiineja koodaavaa geeniä, CLCN2 IR-makakki-haarassa ja aktiivisuuden säätelemä, sytoskelettiin liittyvä proteiini (ARC) CE-makakki-haarassa, kokivat positiivista valintaa. Näiden kahden geenin sekä viiden muun positiivisesti valitun geenin tiedetään jo olevan merkityksellisiä ihmisen geneettisten sairauksien kannalta, mikä osoittaa niiden biologisten toimintojen todennäköisen tärkeyden.

CR- ja CE-makakkojen genomisekvenssien saatavuuden ansiosta pystyimme arvioimaan niiden geneettistä monimuotoisuutta sekä geneettisiä eroja makakoiden ja ihmisten välillä, mikä on tärkeää, kun otetaan huomioon makakoiden merkittävä käyttö biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Makakoiden genomien vertailu paljasti, että ihmisestä puuttuu 25 yhden kopion geeniä (Online-menetelmät ja täydentävä jakso 6), mukaan luettuna kemokiinireseptorigeeni IL32, jolla voi olla merkitystä sekä synnynnäisissä että adaptiivisissa immuunivasteissa ja joka on näin ollen tärkeää ottaa huomioon, kun näitä makakkeja käytetään tartuntatautitutkimuksissa. Lisäksi yhteensä 170 geenissä, jotka liittyvät sairauksiin tai immuniteettiin jossakin makakkilajissa, on joko frameshift-mutaatioita tai ennenaikaisia stop-kodoneja, joiden voidaan ennustaa pseudogenisoineen näitä geenejä (täydentävä jakso 6). Näiden karsivien mutaatioiden aitoutta tukevat sekä transkriptomitiedot ja korkean syvyyden sekvensointilukemat että riippumaton PCR-validointi. Kolmekymmentäkaksi näistä geeneistä toimii immuniteettireiteillä, ja ne näyttävät kadonneen makakeilla. Esimerkiksi tärkeä synnynnäisen immuniteetin geeni DEFA4, joka koodaa yhtä neutrofiilien tuottamista mikrobisidisistä ja sytotoksisista peptideistä11 , on pseudogenisoitunut kaikissa kolmessa makakissa, koska sen ensimmäinen eksoni on kadonnut. Lisäksi Tollin kaltaisen reseptorin 4 (TLR4) geenissä oli 1-bp:n deletio, joka synnyttää ennenaikaisen stop-kodonin sen kolmannessa eksonissa kaikissa kolmessa makakissa (täydentävä jakso 6). TLR4:n on raportoitu olleen positiivisen valinnan kohteena vanhan maailman kädellisillä12. Huomionarvoista on, että joissakin ihmisen sairauksiin liittyvissä geeneissä on myös kehyssiirtymiä niiden makakki-homologeissa. Esimerkiksi havaitsimme, että kaikilla kolmella makakilla oli ennenaikainen stop-kodoni opioidireseptori mu1 (OPRM1) -geenin toisessa eksonissa. OPRM1-geeni koodaa proteiinia, joka on levinnyt kaikkialle neuraakseliin ja ääreishermostoon ja joka on opioidien ensisijainen kohde13 (Täydentävä jakso 6) (Täydentävä jakso 6).

Tutkimme myös geneettisiä eroavaisuuksia ortologeissa, joilla on erityistä merkitystä biolääketieteellisissä tutkimuksissa. Sytoplasminen tripartit-motiiviproteiini 5α (jota koodaa TRIM5-geeni), joka voi rajoittaa monenlaisten retrovirusten replikaatiota, on keskeinen biomarkkeri, jota käytetään HIV-infektion eläinmallien valinnassa14. Kartoittaaksemme TRIM5:n populaation laajuista geneettistä monimuotoisuutta PCR-monistimme ja sekvensoimme TRIM5:n 33:lta Vietnamista peräisin olevalta CE-makakkiyksilöltä ja 28:lta CR-makakkiyksilöltä (online-menetelmät). Emme havainneet aiemmin raportoitua15 Trim5-syklofiliini A:n kimeeraa (TRIM-CypA2) yhdelläkään yksilöllä, mikä viittaa siihen, että tämä genotyyppi on harvinainen näissä populaatioissa. TRIM5-geenissä havaittiin kuitenkin 19 ei-synonyymistä polymorfismia ja yksi mikrodeleetio IR-makakki-referenssiin verrattuna; lähes kaikkien näiden polymorfismien frekvenssit poikkesivat toisistaan näiden kahden populaation välillä (kuva 3 ja täydentävä jakso 7). Tunnistimme myös 6-bp:n deletion TRIM5-geenissä CE-makakissa, joka johtaa kahden aminohapon (Thr339 ja Phe340) menetykseen. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että näiden jäännösten poistaminen voi lisätä HIV:n tai SIV:n patogeenisuutta16. Tämän mutaation suuri esiintymistiheys (97,5 %) havaittiin CE-makakkipopulaatiossa, mikä osoittaa, että tämä deletio on käytännössä vakiintunut CE-makakissa. Sitä vastoin CR-makaakkipopulaatiossa tämän mutaation esiintymistiheys on noin 50 prosenttia, mikä on vain hieman korkeampi kuin IR-makaakkipopulaatiossa (36 prosenttia)17. Tämän 6-bp:n deletion ja muiden polymorfismien esiintymistiheyden vaihtelu eri maantieteellistä alkuperää olevien makakoiden välillä saattaa hyvinkin olla syynä havaittuihin eroihin HIV-resistenssissä näiden makakkalajien/alalajien välillä16. Tutkimme myös muiden tautiin liittyvien geenien geneettistä vaihtelua samassa CE- tai CR-makakipopopulaatiossa ja havaitsimme, että mutaatioita esiintyy usein eri frekvensseillä näissä kahdessa lajissa (täydentävä jakso 7).

Tutkittaessa ihmisen lääkeaineeksi kelpaavien proteiinidomeenien ortologeja makakeissa ja luodaksemme resurssin ”lääkeaineeksi kelpaavan genomin” terapeuttista hyväksikäyttöä varten seuloimme makakoiden ortologit tällä hetkellä tunnetuille lääkeaineille. Lähes kaikki lääkeainekelpoiset ortologit voidaan havaita kolmessa makasiinilajissa/alalajissa, mikä osoittaa, että nämä eläinmallit ovat todennäköisesti toiminnallisesti vastaavia. Hyvin harvoissa tapauksissa makakista löydetty ortologi eroaa kuitenkin ihmisen vastaavasta. Esimerkiksi mitokondriaalinen asyylitransferaasi (GLYATL2), joka siirtää asyyliryhmän glysiiniin, on kadonnut kokonaan kaikista kolmesta makakista. Lisäksi tunnistimme 19 ihmisen geeniä, joilla on lääkeaineita sisältäviä domeeneja ja jotka ovat muuttuneet pseudogeeneiksi makakeissa (täydentävä jakso 7). Esimerkiksi lisäkilpirauhashormoni 1 -reseptorin (PTH1R) geeni, joka on osteoporoosilääkkeen teriparatidin (Forteo)18,19 kohde, sisältää ennenaikaisen stop-kodonin makakeilla. Yksi ihmisen rekombinanttisen keratinosyyttikasvutekijän (Palifermin20) kohdegeenistä, fibroblastikasvutekijän reseptori 3, jota koodaa FGFR3, on myös pseudogenisoitunut makakeilla ennenaikaisen stop-kodonin vuoksi.

Ylimääräistä biolääketieteellistä kiinnostusta herättävät kompensoidut patogeeniset poikkeamat. Nämä edustavat ihmisen oletettavasti patologisia missense-alleeleja, joissa korvaavat aminohapot ovat samanlaisia kuin villin tyypin aminohappojäännökset ortologisissa paikoissa muissa organismeissa. Tunnistimme 931 kompensoitua patogeenistä poikkeamaa neljällä läheisesti sukua olevalla kädellislajilla (simpanssi ja kolme makakkia), joista 220 vaihteli kädellisten välillä, mukaan lukien 65, jotka vaihtelivat kolmen makakkalajin välillä (täydentävä jakso 8 ja täydentävä taulukko 26). Esimerkiksi yksi mutaatio (R40→H40) ornitiinitranskarbamylaasi (OTC) -geenissä oli ilmeinen kahdessa rhesusmakakki-alalajissa mutta ei CE-makakissa. Edellä esitettyjen esimerkkien perusteella on selvää, että tällaisten lajien välisten erojen mahdollinen olemassaolo olisi otettava huomioon, kun valitaan makakkeja käytettäväksi sairauksien malleina.

Geenien ilmentymisprofiilien vertailu (täydentävä jakso 9) CE- ja IR-makakin välillä osoitti, että niiden ortologeilla oli konservoidut ilmentymisprofiilit samoissa kudoksissa. Huomasimme kuitenkin, että kiveksissä ilmeni ilmaisutasoja, jotka poikkesivat enemmän niiden ortologien välillä, joilla oli alhaisemmat Pearsonin korrelaatiokertoimet (Täydentävä jakso 9). Havainto siitä, että useammilla geeneillä on epäjohdonmukaiset ilmentymistasot kiveksissä verrattuna muihin kudoksiin, saattaa liittyä kädellisten siittiöiden ilmentämien geenien nopeaan evoluutionopeuteen21. Transkriptomitietojen avulla pystyttiin myös tunnistamaan useita uusia geenejä CE-makakeissa suhteessa rhesusmakakkeihin.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että kahden makakin genomin sekvensointi ja analyysit vahvistivat, että introgressiivisella hybridisaatiolla oli luultavasti tärkeä rooli mantereelta peräisin olevan CE-makakin genomin muodostumisessa. Näin ollen CE-makakki voisi olla hyödyllinen malli, jonka avulla voidaan tutkia kädellislajien välistä geenien vaihtoa ja tämän prosessin merkitystä kädellisten evoluutiossa ja lajinmuodostuksessa. Tässä esiteltävät kaksi uutta makakin genomia tuovat esiin myös näiden laajalti käytettyjen kädellisten eläinmallien välisen vaihtelun asteen. Erilaisista maantieteellisistä populaatioista peräisin olevissa yksittäisissä makakeissa esiintyvä runsas geneettinen monimuotoisuus kiinnostaa suoraan primatologiaa, prekliinistä lääketiedettä, populaatiogenetiikkaa ja fylogeografisia tutkimuksia.