Linkitysetäisyyden ja geenijärjestyksen johtaminen kolmen pisteen risteytyksistä
Lisäämällä kolmas geeni saadaan nyt useita erilaisia risteytymisen ylituotteita. Seuraavassa kuvassa on esitetty erilaisia mahdollisia yhdistelmätuotteita.
Jos nyt suorittaisimme testiristeytyksen F1:n kanssa, odottaisimme 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1-suhdetta. Kuten edellä kuvatuissa kahden pisteen analyyseissä, poikkeama tästä odotetusta suhdeluvusta osoittaa, että linkittymistä tapahtuu.Paras tapa tutustua kolmen pisteen testiristeytystietojen analyysiin on käydä läpi esimerkki. Käytämme mielivaltaista esimerkkiä geeneistä A, B ja C. Teemme ensin risteytyksen yksilöiden välillä, jotka ovat AABBCC ja aabbcc. Seuraavaksi F1 risteytetään testiristeytyksellä yksilöön, joka on aabbcc. Käytämme seuraavia tietoja geenijärjestyksen ja linkitysetäisyyksien määrittämiseksi.Kuten kahden pisteen tietojen kohdalla, tarkastelemme F1-sukusolujen koostumusta.
| Genotyyppi | Havaittu | Sukusolujen tyyppi | |
|---|---|---|---|
| ABC | Vanhempien | ||
| abc | Vanhempien | ||
| AbC | Yhden-crossover geenien C ja B välillä | ||
| aBc | Single-crossover geenien C ja B välillä | ||
| ABc | |||
| abC | Double-crossover | ||
| Abc | Single-crossover geenien A ja C välillä | ||
| aBC | |||
| Yhteensä |
Paras tapa ratkaista nämä ongelmat on kehittää järjestelmällinen lähestymistapa.Ensin määritetään, mitkä genotyypeistä ovat vanhempien genotyyppejä.Yleisimmin löydetyt genotyypit ovat vanhempien genotyyppejä.Taulukosta selviää, että ABC- ja abc-genotyypit olivat vanhempien genotyyppejä.
Seuraavaksi on määritettävä geenien järjestys. Kun olemme määrittäneetvanhempien genotyypit, käytämme tätä tietoa yhdessä tuplaristeytyksestä saadun tiedon kanssa. Kaksoisristeytyneet sukusolut ovat aina pienimmällä frekvenssillä. Taulukon perusteella ABc- ja abC-genotyypit ovat pienimmällä frekvenssillä. Seuraava tärkeä seikka on se, että kaksoisristeytymistapahtuma siirtää keskimmäisen alleelin toisesta sisarkromatidista toiseen. Näin keskimmäisen geenin ei-vanhempien alleeli siirtyy kromosomille, jossa on kahden vierekkäisen geenin vanhempien alleelit. Taulukosta nähdään, että C-geenin on oltava keskellä, koska resessiivinen c-alleeli on nyt samassa kromosomissa kuin A- ja B-alleelit, ja dominoiva C-alleeli on samassa kromosomissa kuin resessiiviset a- ja palloalleelit.
Nyt kun tiedämme, että geenijärjestys on ACB, voimme ryhtyä määrittämään A:n ja C:n sekä C:n ja B:n välisiä kytkentäetäisyyksiä. Linkitysetäisyys lasketaan jakamalla rekombinanttien sukusolujen kokonaismäärä sukusolujen kokonaismäärällä. Tämä on sama lähestymistapa, jota käytimme aiemmin suorittamissamme kahden pisteen analyyseissä. Erikoista on se, että nyt on otettava huomioon myös kaksinkertaiset risteytymistapahtumat. Näissä laskelmissa otamme nämä kaksinkertaiset risteytymiset mukaan molempien intervallien etäisyyksien laskentaan.
Siten geenien A ja C välinen etäisyys on 17.9 cM ja geenien C ja Bis välinen etäisyys on 7.0 cM .
Kokeillaan nyt ongelmaa Drosophilasta soveltamalla periaatteita, joita käytimme edellä olevassa esimerkissä. Seuraavassa taulukossa on tulokset, joita analysoimme.
| Genotyyppi | Havaittu | Sukusolujen tyyppi | |
|---|---|---|---|
| v cv+ ct+ | Vanhempien | ||
| v+ cv ct | Vanhempien | ||
| v cv ct+ | Yhden-geenien ct ja cv risteytys | ||
| v+ cv+ ct | Single-geenien ct ja cv | ||
| v cv ct | Single-crossover geenien v ja ct | ||
| v+ cv+ ct+ | Single-geenien v ja ct välinen risteytys | ||
| v cv+ ct | Double-crossover | ||
| v+ cv ct+ | Double-crossover | ||
| Yhteensä |
Vaihe 1: Vanhempien genotyyppien määrittäminen.
Runsaslukuisimmat genotyypit ovat vanhemmatyyppejä. Nämä genotyypitovat v cv+ ct+ ja v+ cv ct.Erona ensimmäiseen kolmen pisteen risteytykseemme on se, että toinen vanhempiei sisältänyt kaikkia dominoivia alleeleja ja toinen kaikkia resessiivisiä alleeleja.
Vaihe 2: Geenijärjestyksen määrittäminen
Geenijärjestyksen määrittämiseksi tarvitsemme vanhempien genotyyppejä sekä kaksinkertaisen risteytyksen genotyyppejä Kuten edellä mainitsimme, vähiten esiintyviä genotyyppejä ovat kaksinkertaisen risteytyksen genotyypit. Nämä geenityypit ovatv cv+ ct ja v+ cv ct+.Näiden tietojen perusteella voimme määrittää järjestyksen esittämällä kysymyksen: Mikä vanhemman alleeli ei ole kaksoisristeytysgenotyypeissä assosioitunut niihin kahteen vanhemman alleeliin, joihin se oli assosioitunut alkuperäisessä vanhemmanristeytyksessä. Ensimmäisestä kaksoisristeytyksestä, v cv+ ct,ct-alleeli liittyy v- jacv+-alleeleihin, kahteen alleeliin, joihin se ei liittynyt alkuperäisessä risteytyksessä. Siksi ct on keskellä, ja geenijärjestys on v ct cv.
Vaihe 3: Linkitysetäisyyksien määrittäminen.
-
v – ct etäisyyden laskeminen. Tämä etäisyys saadaan seuraavasti: 100*((89+94+3+5)/1448) = 13.2 cM
-
ct – cv etäisyyden laskeminen. Tämä etäisyys saadaan seuraavasti: 100*((45+40+3+5)/1448) = 6.4 cM
Vaihe 4. Piirretään kartta.
Kolmen pisteen risteytysten avulla voidaan myös mitata interferenssiä (I) kromosomin tietyllä alueella tapahtuvien risteytymistapahtumien välillä.Erityisesti kaksinkertaisen risteytymisen määrä antaa viitteitä siitä, esiintyykö interferenssiä. Periaatteena on, että kun kahdessa vierekkäisessä kromosomiväleissä on tietyt rekombinaatiomäärät, tällä alueella tapahtuvien kaksoisristeytysten määrän pitäisi olla yhtä suuri kuin yksittäisten risteytysten tulo. Edellä kuvatussa esimerkissä v ct cv rekombinaatiotiheys oli 0,132 geenien v ja ct välillä ja rekombinaatiotiheys geenien ct ja cv välillä oli 0,064. Odotettavissa olisi siis 0,84 % kaksoisrekombinaatioita. Kun otoskoko on 1448, tämä merkitsisi 12 kaksinkertaista rekombinanttia. Todellisuudessa havaitsimme vain 8.
Interferenssin mittaamiseksi laskemme ensin coefficient ofcoincidence (c.o.c.), joka on havaittujen ja odotettujen kaksinkertaisten rekombinantien suhde. Interferenssi lasketaan sitten kaavalla 1 – c.o.c.Kaava on seuraava:
V ct cvdatan v ct interferenssiarvo on 33 %.
Useimmiten interferenssiarvot ovat välillä 0-1. Arvot, jotka ovat pienempiä kuin yksi, viittaavat siihen, että interferenssia esiintyy kromosomin tällä alueella.