Escherichia coli -bakteerin aineenvaihduntatekniikka kanelimaldehydin tuotantoa varten

Kanelimaldehydin biosynteesin entsyymien valinta

Kanelimaldehydiä voidaan syntetisoida l-fenyylialaniinista, ja sen biosynteesi edellyttää kolmea entsymaattista reaktiota: (i) l-fenyylialaniinin deaminointi kanelihapoksi fenyylialaniiniammoniakkilyaasin (PAL, EC 4.3.1.24) toimesta, (ii) kanelihapon happo-tioliligaatio kanelihappo-CoA:ksi 4-kumaraatti:CoA -ligaasin (4CL, EC 6.2.1.12), ja iii) kaneli-CoA:n pelkistäminen kaneli-CoA-reduktaasin (CCR, EC 1.2.1.44) toimesta kaneli-CoA:ksi (kuva 1a) . PAL on kaikkialla esiintyvä entsyymi, jota löytyy monista kasveista, sienistä ja joistakin bakteereista, ja sillä on erilaisia toimintoja ja spesifisyyksiä entsyymin alkuperän mukaan. Tutkimme kahta PAL-entsyymiä, joista toinen on peräisin kasvista Arabidopsis thaliana (AtPAL) ja toinen bakteerista Streptomyces maritimus (SmPAL), niiden soveltuvuutta kanelihapon tuottamiseen E. colissa. AtPAL:n isomeerejä on neljä, mukaan lukien AtPAL1:stä AtPAL4:ään, ja aiemmin on raportoitu, että suurimmalla osalla niistä (AtPAL1:llä, 2:lla ja 4:llä) on samankaltaiset korkeammat aktiivisuudet kuin AtPAL3:lla l-fenyylialaniiniin substraattina, joten valitsimme AtPAL1:n edustavaksi kasvilähteestä. Niiden kineettisten vakioiden (Km) ilmoitettiin olevan 68 ja 23 μM . Kukin His-merkitty PAL-entsyymi tuotettiin E. coli BL21(DE3) -entsyymissä ja puhdistettiin ”Menetelmissä” kuvattujen menettelyjen mukaisesti. Molemmat entsyymit, AtPAL1 (78 kDa) ja SmPAL (56 kDa), puhdistettiin onnistuneesti (lisätiedosto 1: kuva S1). Vaikka AtPAL1:n ekspressiotaso ei ollut niin korkea, että kaistaa ei voitu nähdä SDS-PAGE:n kaistoilla 1 ja 2, AtPAL1:n kaista voitiin selvästi nähdä affiniteettipylväs-kromatografian jälkeen kaistalla 3, johon konsentroitu eluaatti ladattiin. Kunkin puhdistetun PAL-entsyymin ekvivalenttimolaarisuus inkuboitiin saman määrän l-fenyylialaniinia (substraattina) kanssa, ja kanelihapon tuotantotitteri kvantifioitiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) (lisätiedosto 2: kuva S2). Kuten kuvasta 1b käy ilmi, SmPAL:lla oli huomattavasti suurempi aktiivisuus (21-kertainen 30 °C:n reaktiossa ja 27-kertainen 37 °C:n reaktiossa) kuin AtPAL1:llä.

Tutkimme myös kahden eri 4CL-entsyymin, toisen Streptomyces coelicolorista (ScCCL) ja toisen A. thalianasta (At4CL), soveltuvuutta muuntaa kanelihappoa kanelimaldehydiksi E. colissa. At4CL:n tiedetään olevan 14 oletettua isoformia (At4CL1-At4CL14). 14 isomuodosta At4CL1-3:lla on samankaltainen aktiivisuus sinnamaatin suhteen, kun taas muilla isomuodoilla ei ole . Siksi valitsimme At4CL1:n edustavaksi. Käytimme myös A. thalianasta peräisin olevaa CCR-entsyymiä (AtCCR1) cinnamoyl-CoA:n muuntamiseen cinnamaldehydiksi . Kutakin 4CL-entsyymiä (At4CL1 ja ScCCL ) testattiin yhdessä A. thalianan CCR-entsyymin (AtCCR) kanssa. Kaikki entsyymit puhdistettiin menestyksekkäästi ja suurella puhtaudella (lisätiedosto 1: kuva S1). At4CL1:n ja ScCCL:n entsymaattisten aktiivisuuksien vertailemiseksi valmistettiin kaksi reaktiota, i) At4CL1 AtCCR:n kanssa ja ii) ScCCL AtCCR:n kanssa, ja ne sekoitettiin keskenään, kun substraattina oli kanelihappo. Inkuboinnin jälkeen 30 ja 37 °C:n lämpötiloissa kanelialdehydin titraus analysoitiin HPLC:llä. Kuten kuvasta 1c käy ilmi, ScCCL:n ja AtCCR:n yhdistelmä johti suurempaan kanelimaldehydin tuotantotitteriin (4,4-kertainen 30 °C:n reaktiossa ja 10,4-kertainen 37 °C:n reaktiossa) kuin At4CL1:n ja AtCCR:n yhdistelmä. Näiden tulosten perusteella rakensimme kanelimaldehydin biosynteesijärjestelmän E. coli -bakteerissa jäljempänä kuvatulla tavalla käyttäen seuraavia entsyymejä: SmPAL, ScCCL ja AtCCR.

Kinnamaldehydin biosynteesireitin rakentaminen E. coli -bakteerissa

Kinnamaldehydin tuottamiseksi E. coli -bakteerissa SmPAL-, ScCCL- ja AtCCR-geenit kloonattiin pTrc99A:han seuraavassa järjestyksessä: SmPAL, ScCCL ja AtCCR (jolloin saadaan pHB-CAD) (kuva 2a). pHB-CAD:tä sisältävää E. coli W3110:tä kasvatettiin kahdessa eri lämpötilassa (30 ja 37 °C), jotta löydettäisiin optimaalinen lämpötila kanelimaldehydin tuotannolle. Entsyymien ilmentyminen analysoitiin SDS-PAGE:lla, jota seurasi western blot -analyysi, kuten on kuvattu kohdassa ”Menetelmät”. Molemmissa lämpötiloissa kaikki entsyymit ilmentyivät hyvin ja olivat hyvin liukoisia (kuva 2b). Vaikka kukin entsyymi ilmentyi eri tasolla, kunkin entsyymin ilmentyminen oli marginaalisesti parempaa 37 °C:ssa kuin 30 °C:ssa. Myös elatusaineeseen tuotetun kanelimaldehydititterin analysointi HPLC:n avulla osoitti, että kanelimaldehydin tuotantotitteri oli 4,5-kertainen 37 °C:ssa verrattuna 30 °C:een (kuva 2c). Oletimme, että korkeampi cinnamaldehydin tuotantotitteri 37 °C:ssa johtui kaikkien biosynteettisten entsyymien lisääntyneestä ilmentymistasosta 37 °C:ssa, vaikka nämä entsyymit ovat aktiivisia 30 °C:ssa. Jäljempänä kaikki kasvatukset kanelimaldehydin tuotantoa varten suoritettiin 37 °C:ssa.

Viljelytekniikka l-fenyylialaniinin solunsisäisen reservin lisäämiseksi

Kinnamaldehydin biosynteesiin tarvitaan l-fenyylialaniinia välttämättömänä esiasteena . Siksi kanelimaldehydin tuotannon tehostamiseksi on suotavaa lisätä solunsisäistä l-fenyylialaniinivarastoa. Tätä tarkoitusta varten suunnittelimme rationaalisesti uudelleen E. colin tuottamaan l-fenyylialaniinia enemmän. Saatavilla olevia aineenvaihduntaa ja sääntelyä koskevia tietoja apuna käyttäen muokkasimme E. coli W3110:n seuraavasti: (i) crr-geenin poistaminen, joka koodaa EIIAGlc-proteiinia, joka liittyy glukoosispesifiseen fosfoenolipyruvaatti-fosfotransferaasijärjestelmään (PTS) substraatin ottonopeuden kohtuullistamiseksi, aineenvaihduntatuotteiden ylivuodon vähentämiseksi ja esiasteiden rikastamiseksi, (ii) tyrR-geenin poistaminen aromaattisten aminohappojen (AAA) synteesigeenejä sisältävän TyrR-regulonin tiukan säätelyn lieventämiseksi, (iii) trpE- (antranilaattisyntaasin komponentti) ja tyrA-geenien poistaminen, jotta estetään hiilivirran häviäminen kilpaileville reiteille (l-tryptofaanin ja l-tyrosiinin biosynteesi), ja (iv) pykA-geenin (pyruvaattikinaasi A) poistaminen, jotta esiaste rikastuisi ja jotta tasapainotettaisiin kasvun ja l-fenyylialaniinin tuotannon välinen virtaus (kuva. 3). Edellä esitetyn kaavion perusteella kehitettiin viisi peräkkäistä E. coli W3110:n knockout-mutanttia (YHP01-YHP05) (taulukko 1).

Ensiksi glukoosispesifinen fosfoenolipyruvaatti-PTS inaktivoitiin deletoimalla crr-geeni E. coli W3110 -kannassa, jolloin saatiin E. coli YHP01. Vaikka tämä häiritsee glukoosin sisäistämisen pääjärjestelmää, YHP01 voi silti kasvaa määritellyissä väliaineissa, jotka sisältävät glukoosia ainoana hiililähteenä, koska mannoosispesifinen PTS ja galaktoosipermeaasi voivat edelleen sisäistää glukoosia sytoplasmaan. PTS:n ohittaminen johtaa fosfoenolipyruvaatin (PEP) määrän lisääntymiseen, mikä lopulta helpottaa l-fenyylialaniinin synteesiä . Seuraavaksi poistimme tyrR-geenin YHP01:stä YHP02-kannan tuottamiseksi. TyrR-proteiini on säätelijä TyrR-regulonissa, joka sisältää kahdeksan AAA:n biosynteesiin osallistuvaa geeniä . Sen poistaminen voi myös lisätä l-fenyylialaniinivarastoa lieventämällä AAA-synteesiin liittyvien geenien tiukkaa säätelyä. Seuraavaksi deletoitiin peräkkäin trpE- ja tyrA-geenit alkaen YHP02-kannasta, jolloin saatiin YHP03- ja YHP04-kannat. AAA-yhdisteiden biosynteesireitillä on viimeinen haarautumiskohta, jossa PheA-, TrpE- tai TyrA-entsyymit voivat muuntaa korismaatin l-fenyylialaniiniksi, l-tryptofaaniksi tai l-tyrosiiniksi. TrpE- ja tyrA-geenien deleetioilla voidaan estää hiilen häviäminen kilpaileville l-tryptofaanin ja l-tyrosiinin biosynteesireiteille. Lopuksi poistimme pykA-geenin YHP04:stä YHP05-kannan tuottamiseksi. PykA-geeni koodaa pyruvaattikinaasi A:ta (PykA), joka muodostaa toisen PEP:tä kuluttavan vaiheen. Poistamalla pykA-geeni voidaan käyttää enemmän PEP:tä shikimaattireitillä ja näin ollen tuottaa enemmän l-fenyylialaniinia. Jokaisessa kannassa (YHP01-YHP05) geenien deletointi todennettiin PCR:llä ja agaroosigeelielektroforeesilla (lisätiedosto 3: kuva S3).

Kaikkia muokattuja E. coli -kantoja, mukaan lukien YHP01-YHP05 ja emoeläin E. coli W3110, kasvatettiin ravistelupulloissa, jotka sisälsivät puolimääriteltyjä väliaineita, ja solukasvua ja l-fenyylialaniinin tuotantoa verrattiin. 48 tunnin viljelyn jälkeen kaikki muunnetut kannat kasvoivat hieman paremmin kuin W3110-kanta; erityisesti E. coli YHP05 -kannalla oli suurin solutiheys (kuva 4a). Aiemmassa tutkimuksessa havaittiin myös, että PTS- ja Pyk-isotsyymien inaktivointi lisäsi hiilivirtaa biomassan muodostukseen, koska glukoosin vähentyneestä ottamisesta ja kataboliasta johtuvien välimetaboliittien määrät vähenivät. Analysoimme myös l-fenyylialaniinin tuotantotitteriä viljelmän supernatantissa HPLC:llä. W3110-alkuperäkannassa l-fenyylialaniinin tuotantotitteri oli 0,24 g/l, mutta l-fenyylialaniinin tuotantotitteri kasvoi asteittain muunnetuissa E. coli -kannoissa (kuva 4a). E. coli YHP05, jossa crr-, tyrR-, trpE-, tyrA- ja pykA-geenit oli poistettu, osoitti korkeinta l-fenyylialaniinin tuotantotitteriä (0,52 g/l), joka oli 2,2-kertainen vanhempien E. coli W3110:een verrattuna. Siksi päätimme käyttää E. coli YHP05 -kantaa jatkokehityksessä.

Plasmidipohjainen yliekspressiojärjestelmä l-fenyylialaniinin solunsisäisen poolin lisäämiseksi

Alkaen E. coli YHP05 -kannasta l-fenyylialaniinin tuotantoa parannettiin entisestään plasmidipohjaisella geenin yliekspressiolla. Shikimaatin ja l-fenyylialaniinin aiheuttamaa takaisinkytkentäistä inhibitiota l-fenyylialaniinisynteesireitillä vähennettiin yliekspressoimalla isotsyymiä tai tuomalla mutaatioita shikimaattireittiin osallistuviin entsyymeihin seuraavasti: (i) 3-deoksi-d-arabinoheptulosonaatti-7-fosfaatti (DAHP) -syntaasigeenin yliekspressio, jota koodataan aroG:ssä insinöörityönä (AroG8/15), (ii) ydiB- ja aroK-geenien yliekspressio, jotka koodaavat shikimaattidehydrogenaasia ja shikimaattikinaasia hiilen virtauksen lisäämiseksi shikimaattiradalle, (iii) CHA-mutaasia/prefenaattidehydraasia koodaavan pheA-geenin yliekspressio, jossa on tehty muutoksia substraatin sitoutumisaffiniteetin parantamiseksi (PheAfbr, dm), ja iv) galP- (galaktoosipermeaasi) ja glk- (glukokinaasi) -geenien yliekspressio glukoosinoton helpottamiseksi (Additional file 4: Kuva S4).

Aluksi takaisinkytkennän eston lieventämiseksi rakennettiin plasmidi pTac15kG, joka sisälsi muunnetun aroG8/15-geenin. AroG on tärkein DAHP:n synteesiin osallistuva entsyymi, mutta l-fenyylialaniini inhiboi AroG:n täysin (jopa 0,1 mM) . Tiedetään, että kahden mutaation (D146N ja A202T) käyttöönotto johti resistenssiin takaisinkytkentäinhibitiota vastaan vaikuttamatta sen korkeaan spesifiseen aktiivisuuteen (AroG8/15) , joten yliekspressoimme tätä mutanttia AroG8/15-entsyymiä. Seuraavaksi rakennettiin kaksi plasmidia (pTac15kGB ja pTac15kGBK) ydiB- ja aroK-geenien sekä aroG8/15-geenin yliekspressoimiseksi. Metabolista virtausta shikimaattireitille voidaan lisätä, kun shikimaattidehydrogenaasia (YdiB) ja shikimaattikinaasia (AroK) yliekspressoidaan . Myöhemmin rakennettiin myös pTac15kGBKA-plasmidi pheA-geenin yliekspressoimiseksi, joka koodaa mutaatioilla varustettua korsimaattimutaasia/prefenaattidehydraasia. Tässä konstruktiossa monistettiin vain villityypin PheA:n (PheAfbr) ensimmäiset 300 aminohappoa, mikä sulkee pois säätelydomeenin; näin ollen takaisinkytkennän esto vaikuttaa heikosti PheAfbriin. Koska PheAfbr:n Km-arvo on korkeampi kuin villityyppisen PheA:n, mikä heijastaa sen vähentynyttä sitoutumisaffiniteettia substraattiin , lisäsimme PheAfbr:iin kaksi mutaatiota (E159A ja E232A) parantaaksemme sen substraattiin sitoutumisaffiniteettia ja saimme tulokseksi PheAfbr:n, dm . Lopuksi rakennettiin pYHP-plasmidi galP- ja glkgeenien yliekspressoimiseksi, jotka koodaavat galaktoosipermeaasia ja glukokinaasia. Molemmat entsyymit helpottavat glukoosin ottoa.

Viiden plasmidin, mukaan lukien pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, pTac15kGBKA ja pYHP (taulukko 1), rakentamisen jälkeen kukin plasmidi muunnettiin E. coli YHP05:een. Kun soluja oli viljelty 48 tuntia ravistelupulloissa, jotka sisälsivät puolimääriteltyä elatusainetta, solujen kasvu ja l-fenyylialaniinin tuotantotitteri analysoitiin. Kaikki solut kasvoivat hyvin, ja erityisesti pYHP:tä sisältävä E. coli YHP05 kasvoi muita soluja hieman suurempaan solutiheyteen (OD600 = 9,76) (kuva 4b). Analysoimme myös l-fenyylialaniinin tuotantotitterin kasvatusnesteessä HPLC:llä. AroG8/15-geenin (pTac15kG) yliekspressio johti l-fenyylialaniinin tuotannon merkittävään lisääntymiseen (2,25 g/l) verrattuna YHP05:een, jossa ei ollut plasmidia (0,52 g/l) (kuva 4b). Muiden geenien myöhempi yliekspressio johti l-fenyylialaniinin tuotantotitterin sarjalliseen kasvuun, ja E. coli YHP05:llä, jossa on pYHP, oli korkein l-fenyylialaniinin tuotantotitteri (3,91 g/l) (kuva 4b). PYHP-plasmidin vaikutus johti l-fenyylialaniinin tuotannon merkittävään lisääntymiseen 16,4-kertaiseksi ja 7,5-kertaiseksi. PYHP:tä sisältävän E. coli YHP05:n viljelyssä l-fenyylialaniinin tuotto glukoosilla oli 0,270 g/g ja tuottavuus 0,082 g/L/h (lisätiedosto 5: kuva S5). Näin ollen pYHP:tä sisältävän muunnetun E. coli YHP05:n l-fenyylialaniinivarasto parani merkittävästi. Liu et al. raportoivat aiemmin l-fenyylialaniinin tuotannosta E. colissa jopa 47 g/l . Tämä ennätys saavutettiin kuitenkin syöttöeräviljelyssä (15 l:n mittakaavassa), ja he käyttivät l-fenyylialaniinin kuljettajan (YddG) yhteisekspressiota l-fenyylialaniinin tehokkaaseen tuotantoon elatusaineeseen. Omassa työssämme emme ottaneet käyttöön YddG:tä, koska työmme perimmäinen tavoite ei ollut l-fenyylialaniinin tuotanto vaan kanelialdehydin tuotanto. Vaikka työssämme saavutettu l-fenyylialaniinin titteri ei ollutkaan ennätyksellisen korkea, se oli mielestämme riittävän korkea kanelimaldehydin tuotantoon. Siksi päätimme käyttää tätä muunneltua kantaa kanelimaldehydin tuotantoon.

Kanelimaldehydin tuotanto muunnellussa E. coli -bakteerissa

Käyttämällä muunneltua E. coli YHP05 -bakteeria, joka sisältää pYHP:tä, tutkimme ensin kanelihapon tuotantoa. Tätä koetta varten rakennettiin plasmidi pHB-CA, joka sisältää SmPAL-geenin IPTG-indusoitavan trc-promoottorin alla (taulukko 1). Sekä pHB-CA:ta että pYHP:tä sisältävää E. coli YHP05:tä viljeltiin pulloissa 48 tuntia, ja kanelihapon tuotantotitteriä analysoitiin. E. coli YHP05 ja E. coli W3110, jossa oli pHB-CA (ilman pYHP:tä), tutkittiin myös kontrolleina. Kaikkien solujen kasvumallit olivat samanlaiset (kuva 5a), ja pHB-CA:ta sisältävä E. coli W3110 tuotti 79 mg/l ja YHP05 108 mg/l kanelihappoa (kuva 5b). Sekä pHB-CA:ta että pYHP:tä sisältävällä E. coli YHP05:llä oli huomattavasti parempi tuotantotitteri (287 mg/l), joka oli 3,6-kertainen ja 2,7-kertainen verrattuna pHB-CA:ta sisältävään E. coli W3110:een ja pHB-CA:ta sisältävään E. coli W3110:een ja pYHP05:een (kuva 5b). Tietojemme mukaan tämä tuotantotitteri oli myös 1,5-kertainen korkeimpaan E. coli -bakteerilla raportoituun tasoon (186 mg/l) verrattuna. Tämä tulos osoittaa selvästi, että l-fenyylialaniinin määrän lisääminen muunnetussa E. coli -kannassa vaikuttaa myönteisesti kanelihapon tuotannon lisääntymiseen.

Päätavoitteena oli tutkia kanelimaldehydin tuotantoa muunnetussa E. coli YHP05 -kannassa, joka oli muunnettu pHB-CAD:lla ja pYHP:llä. Myös E. coli YHP05 ja E. coli W3110, jossa on pHB-CAD (ilman pYHP:tä), tutkittiin kontrolleina. Solujen kasvu oli samanlaista (kuva 6a), ja kolme kanelimaldehydin biosynteettistä entsyymiä ilmentyi hyvin kaikissa tutkituissa soluissa (lisätiedosto 6: kuva S6). Kun kolviviljelyä oli jatkettu 48 tuntia, viljelmän supernatantit kerättiin ja kanelimaldehydin tuotantotitterit määritettiin HPLC:llä. E. coli W3110:n (pHB-CAD) ja E. coli YHP05:n (pHB-CAD) cinnamaldehydin tuotantotitterit olivat 2,18 ja 6,3 mg/l (kuva 6b). Sitä vastoin E. coli YHP05 (pHB-CAD ja pYHP) osoitti huomattavasti korkeampaa tuotantotitteriä (75 mg/L), joka oli 35-kertainen E. coli W3110:een (pHB-CAD) verrattuna.

Teknisesti muunnetun E. coli -bakteerin tuottaman kanelimaldehydin nematicidinen aktiivisuus

Voidakseen arvioida kasvatusmediumissa tuotetun kanelimaldehydin nematicidista aktiivisuutta kanelimaldehydillä käsiteltiin sukkulamatoja, B. xylophilus -bakteereita kanelimaldehydin kanssa ”Menetelmissä” kuvattujen menettelytapojen mukaisesti . E. coli YHP05:n, jossa oli pYHP ja pHB-CAD, kasvatusneste laimennettiin, kunnes kanelimaldehydin lopullinen pitoisuus oli 60 mg/l, ja sukkulamadot käsiteltiin laimennetulla kasvatusnesteellä. Yhden ja neljän tunnin kuluttua vain 26 prosenttia ja alle 18 prosenttia nematodeista selvisi hengissä (kuva 7). Positiivisena kontrollina nematodeja käsiteltiin kaupallisesti saatavilla olevalla ja puhdistetulla cinnamaldehydillä vastaavalla pitoisuudella (60 mg/l). Neljän tunnin kuluttua lähes kaikki sukkulamadot (95 %) olivat kuolleet. Nämä tulokset osoittivat, että kaupallisesti hankitun ja tässä tutkimuksessa tuotetun kanelimaldehydin nematisidiset vaikutukset olivat samanlaiset. Negatiivisena kontrollina testattiin myös E. coli W3110:n viljelmän supernatanttia, ja odotetusti lähes kaikki nematodit jäivät eloon (>92 %) 4 h:n kuluttua.