KESKUSTELU
Citrobacter freundii on merkittävä opportunististen infektioiden aiheuttaja; C. diversus -bakteeri aiheuttaa noin 40 %:ia tapauksista, kun taas C. freundiire -bakteeri edustaa noin 29 %:ia (11). Citrobacterspp. aiheuttaa vastasyntyneiden aivokalvontulehdusta, ja sillä on epätavallinen taipumus aiheuttaa aivopaise (8, 14). Aivokalvontulehdusta ja aivoabskessia aiheuttavien Citrobacter spp. -bakteerien patogeneesi ei ole hyvin tunnettu, mutta kuten muidenkin aivokalvontulehdusta aiheuttavien bakteerien kohdalla, niiden on läpäistävä veri-aivoeste. Tässä tutkimuksessa pyrittiin ymmärtämään paremmin Citrobacterin mahdollisia vuorovaikutuksia veri-aivoesteen kanssa. C. freundii valittiin mallibakteeriksi näitä tutkimuksia varten, koska bakteerien genetiikka on paremmin määritelty ja genomikirjasto on käytettävissä mahdollisia tutkimuksia varten, jotka koskevat Citrobacterin invaasion ja lisääntymisen molekyyliperustaa HBMEC:ssä. Kokeet, jotka suoritettiin C. diversus -bakteerin aivo-selkäydinnesteen isolaatilla, antoivat samanlaisia tuloksia (tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että näiden kahden lajin HBMEC-invaasion taajuus ja mekanismi voivat olla samankaltaisia.
Veri-aivoeste on monimutkainen rakenne, joka koostuu suonikalvopleksin epiteelistä ja aivojen kapillaarikapillaarien endoteelistä. Tiiviiden liitosten läsnäolo ja endoteelisolujen vähäinen pinosytoottinen aktiivisuus johtavat siihen, että veri-aivoesteen läpi kulkevat makroelementit rajoittuvat. Tällä hetkellä ei tiedetä, mihin kohtaan veri-aivoestettä C. freundii tunkeutuu, mutta suonikalvopleksuksen todettiin olevan harvoin mukana kokeellisen hematogeenisen Citrobacter-meningiitin imeväisikäisen rotan mallissa (16). Lisäksi endoteelin mikrovaskulaarisolut kattavat veri-aivoesteen suurimman pinta-alan, ja muiden meningiittiä aiheuttavien bakteerien on osoitettu tunkeutuvan mikrovaskulaarisiin endoteelisoluihin in vitro (13, 20, 25). Siksi valitsimme HBMEC:t tutkimukseemme. Kudosviljelmien invasiomääritykset ja TEM-tutkimukset osoittivat, että C. freundii tunkeutuu HBMEC:iin. Erilaisten eukaryoottisolujen inhibiittoreiden läsnä ollessa suoritettujen invasiomääritysten tulokset viittaavat siihen, että C. freundii:n invaasio HBMEC:iin on mikrofilamentti-, mikrotubulus-, de novo -proteiinisynteesi- ja endosomin happamoitumisesta riippuvainen prosessi. Laajennetuissa invaasiomäärityksissä todettiin, että C. freundii voi selviytyä ja lisääntyä solunsisäisesti pitkiä aikoja in vitro. TEM-analyysit paljastivat yksittäisten ja useiden C. freundii -solujen solunsisäisen sijainnin yhden kalvon tyhjiön kaltaisissa rakenteissa. Transwell-kokeet osoittivat, että C. freundii pystyi läpäisemään HBMEC:n polarisoidun monokerroksen, kun taas ei-invasiivinen E. coli ei pystynyt. Lisäksi alustavat tietomme osoittavat, että C. freundii läpäisee veri-aivoesteen vastasyntyneiden rottien kokeellisen hematogeenisen aivokalvontulehduksen mallissa (21). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että C. freundii tunkeutuu vakuoleihin, mahdollisesti replikoituu, transsytoi HBMEC:n läpi, vapautuu basolateraaliselle puolelle ja läpäisee siten veri-aivoesteen.
C. freundii:n on raportoitu tunkeutuvan eukaryoottisoluihin (22, 35). Tämä on kuitenkin ensimmäinen raportti C. freundii:n invaasiosta HBMEC:iin. Kummallista kyllä, C. freundii -invaasion eukaryoottiset vaatimukset ovat yhtä moninaiset kuin solutyypit, joihin C. freundii:n on osoitettu tunkeutuvan. Esimerkiksi klatriinipäällysteisen kuopan estäjän MDC:n on osoitettu estävän C. freundii -invaasiota kaikissa muissa tutkituissa solutyypeissä (esim. ihmisen verisuoni-, suolisto- ja virtsarakon epiteelisoluissa) lukuun ottamatta HBMEC:tä, kuten tässä tutkimuksessa osoitettiin. Lisäksi muut tähän mennessä luonnehditut aivokalvontulehdusta aiheuttavat bakteerit tunkeutuvat HBMEC:iin reittiä (reittejä) pitkin, joka on riippuvainen mikrotubuluksista ja on MDC:lle herkkä (20, 24, 27). Klatriinipäällysteisten kuoppien estäjien MDC:n ja ouabaiinin ei ole osoitettu estävän kaikkia reseptoreita; voi siis olla, että HBMEC:n C. freundii -bakteerin invaasioon tarvittavaan reseptoriin ei vaikuta estäjä MDC tai ouabaiini. Vaikka tähän mennessä kerätyt todisteet viittaavat siihen, että C. freundii ei ehkä pääse HBMEC:hen MDC:lle tai ouabainille herkän reseptorivälitteisen reitin kautta, näyttää kuitenkin siltä, että endosomien happamoituminen ja de novo -proteiinisynteesi ovat molemmat välttämättömiä. Käytettävissä olevat tiedot viittaavat kahteen mahdolliseen skenaarioon. Endosomin happamoitumista voidaan tarvita ympäristön laukaisevana tekijänä solunsisäisen bakteerin selviytymiselle. Salmonellan epiteeliin tunkeutumiselle on todettu olevan samanlaisia vaatimuksia (26). Vaihtoehtoisesti endosomin happamoituminen ja proteiinisynteesi voivat olla välttämättömiä ligandi-reseptorikompleksin erottumiselle, reseptorin synteesille ja/tai reseptorin esittelylle HBMEC:n pinnalle, jotta C. freundii-invaasio voi tapahtua. Jälkimmäinen skenaario muistuttaa muita invasiivisia patogeenejä, joissa elinkelpoisen organismin kosketus on tarpeen invasiolle välttämättömien eukaryoottisten solujen adheesiomolekyylien (esim. Streptococcus pneumoniae ja verihiutaleita aktivoivan tekijän reseptori) muokkaamiseksi (2). Laboratoriossamme tehdään parhaillaan kokeita näiden ehdotettujen skenaarioiden erottamiseksi toisistaan.
Invaasiomääritykset, jotka suoritettiin mikrotubuluksen estäjien (sekä depolymerisoivien että stabiloivien aineiden) läsnä ollessa, vähensivät merkittävästi HBMEC:n kykyä ottaa vastaan C. freundii. Konfokaalimikroskopiakokeet anti-α-tubuliinivasta-aineilla osoittivat, että mikrotubulukset aggregoituvat sen jälkeen, kun HBMEC on joutunut kosketuksiin C. freundiin. Mikrotubulusten aggregaatio oli ajasta riippuvainen prosessi; aggregaatiota ei havaittu 5 minuutissa, sitä havaittiin vähän 15 minuutissa, ja selvää aggregaatiota havaittiin, kun C. freundii oli inkuboitu HBMEC:n kanssa 30 minuuttia. Mikrotubulusten aggregaatio estyi, kun soluja käsiteltiin joko mikrotubulusten estäjillä tai mikrofilamenttia estävillä aineilla. Mielenkiintoista on, että mikrotubulusten aggregaation värjäytymiskuvio ei ollut kolokalisoitunut bakteerien sitoutumisen kanssa, ja HBMEC:n alueilla, joilla ei havaittu C. freundii -bakteerin sitoutumista, havaittiin myös voimakasta mikrotubulusten paakkuuntumista. Tämä viittaa siihen, että bakteerien ja HBMEC:n välinen kontakti voi globaalisti stimuloida mikrotubulusten aggregaatiota. Nähtäväksi jää, johtuuko mikrotubulusten aggregaatio eritetystä bakteeritekijästä vai parakriinisestä vasteesta HBMEC:hen sitoutuville bakteereille. Lisäksi mikrotubulusten aggregaatio vastauksena C. freundii -bakteerin sitoutumiseen voi liittyä oletettuun reseptorin esittelyyn de novo -proteiinisynteesin ja endosomin happamoitumisen kautta. Aiemmin on osoitettu, että monien reseptorien kulkeutuminen solun pinnalle ja sieltä pois on riippuvainen mikrotubuluksista (10). Näin ollen yksi selitys mikrotubulusten estäjien estävälle vaikutukselle C. freundii -bakteerin tunkeutumiseen HBMEC:iin on se, että aineet saattavat vähentää C. freundii -bakteerin tunkeutumista välittävien HBMEC-reseptorien määrää. Kokeet näiden mahdollisuuksien erottamiseksi ovat käynnissä.
Mikrotubulusten on aiemmin osoitettu olevan välttämättömiä monien patogeenien (esim. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropatogeeninen ja enterohemorraginen E. coli ja Campylobacter jejuni) invaasiolle (4, 9, 22, 23, 29). Yleinen käsitys on ollut, että vaikka nämä taudinaiheuttajat voivat kulkeutua mikrotubuluksesta riippuvaisia reittejä pitkin, ne eivät yleensä lisäänny solunsisäisesti (6). Tässä tutkimuksessa laajennetuista invaasiomäärityksistä ja TEM-analyysistä saadut tiedot viittaavat siihen, ettäC. freundii saattaa olla poikkeus tästä yleistyksestä. Toisin kuin toisesta intravacuoleissa lisääntyvästä bakteerista, Legionella pneumophila -bakteerista, on kuvattu (12), mitokondrioita tai ribosomeja ei näkynyt bakteerien läheisyydessä. Tämä viittaa siihen, että C. freundii ei ehkä käytä näitä organelleja suoraan energian hankkimiseen tai että tiettyjen isäntäsolun proteiinien rekrytointia ei ehkä tarvita solunsisäiseen selviytymiseen ja lisääntymiseen (kuten L. pneumophilan tapauksessa). Keskushermostoinfektioiden kannalta on erityisen tärkeää, että muiden aivokalvontulehdusta aiheuttavien bakteerien, kuten E. coli K1:n, GBS:n ja S. pneumoniae:n, on vastaavasti osoitettu tunkeutuvan (1, 13, 25) BMEC:iin tai tunkeutuvan sinne ja siirtyvän sinne transsytoosiin (20, 27); näiden organismien ei kuitenkaan ole havaittu lisääntyvän HBMEC:ssä. Kuten edellä on kuvattu, Citrobacter-meningiitin on todettu aiheuttavan runsaasti aivopaiseiden muodostumista. On vielä selvittämättä, onko replikaatio HBMEC:n vakuoleissa ainutlaatuista Citrobacterille ja onko sillä korrelaatio paiseiden muodostumiseen.
Sytokalasiini D estää C. freundii:n tunkeutumisen HBMEC:iin; immunovärjäyksen avulla emme kuitenkaan havainneet havaittavissa olevaa mikrofilamenttien uudelleenjärjestäytymistä C. freundii:n ollessa vuorovaikutuksessa HBMEC:n kanssa (tietoja ei ole esitetty). Lisäksi HBMEC:n sytokalsiini D:n esikäsittely esti bakteerista riippuvaa mikrotubulusten aggregaatiota konfokaalimikroskopialla visualisoituna. Näille tuloksille voi olla useita selityksiä. Sytokalsiini D:n vaikutus bakteeri-riippuvaiseen mikrotubulusten aggregaatioon voi johtua mikrofilamenttien estäjän epäsuorista vaikutuksista mikrotubulusten verkostoon. Mikrotubulusten on esimerkiksi havaittu toimivan ankkurointirakenteina F-aktiinille (28). Näin ollen mikrofilamenttiverkoston häirintä voi vaikuttaa mikrotubulusten verkostoon ja siten epäsuorasti mikrotubuluksista riippuvaiseen C. freundii -invaasioon HBMEC:hen. Vaihtoehtoisesti aktiinista riippuvainen invaasiovaihe voi edeltää mikrotubuluksista riippuvaista vaihetta C. freundii -bakteerin invaasiossa HBMEC:hen. Tämä alkuvaihe voi johtaa mikrofilamenttien uudelleenorganisoitumiseen, kun bakteerit ovat aluksi kosketuksissa HBMEC:n kanssa; nämä tapahtumat voivat kuitenkin olla ohimeneviä, eikä immunofluoresenssimikroskopiaa hyödyntävä koejärjestely välttämättä havaitse riittävästi niiden esiintymistä. Samanlainen tilanne on havaittu Yersinia-vasiinivälitteisen invaasion kohdalla (36). Jos sytokhalasiini D estää invaasion alkuvaiheet, invaasion myöhemmät vaiheet, jotka ovat riippuvaisia mikrotubuleista, eivät siis käynnisty. Aiemmin on osoitettu, että aktiini toimii aktiinia sitovien proteiinitekijöiden siirtymisessä plasmakalvolle sekä sytosolisessa signaloinnissa (19). Lisäksi sytokalasiini D estää Salmonellan kulkeutumista häiritsemällä aktiinia sitovien proteiinien translokaatiota bakteerin kulkeutumiskohtaan (7). On mahdollista, että C. freundii -bakteerin tunkeutumisessa HBMEC:hen aktiinimikrofilamentit ovat välttämättömiä sytosolisessa signaloinnissa ja/tai bakteerien tunkeutumisessa plasmakalvolla, ja mikrotubulukset voivat olla välttämättömiä kalvoon sitoutuneiden bakteerien kuljettamisessa plasmakalvolta kohti basolateraalista puolta (tai vain syvemmälle soluun). Näin ollen häiriö jommassakummassa invaasion vaiheessa johtaisi ”liikenneruuhkaan.”
Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä esitetyt tulokset osoittavat, että C. freundii voi tunkeutua HBMEC:iin in vitro, lisääntyä sen sisällä ja läpäistä sen sytokiinejä. Näiden fenotyyppien geneettisen perustan määrittäminen antaa merkittävää tietoa Citrobactermeningiitin patofysiologiasta ja mahdollisesti auttaa uusien terapeuttisten ja ennaltaehkäisevien strategioiden kehittämisessä. Lisäksi Citrobacterin ja muiden aivokalvontulehdusta aiheuttavien bakteerien laajamittainen molekyylien vertaileva analyysi voi valottaa Citrobacterin ainutlaatuista ominaisuutta muodostaa aivopaiseja.