Vuoden 1000 eaa. tienoilla siirtolaisaalto asettui Tiberin laakson yläosaan aina Adrianmerelle asti ja myös Assisin lähistölle. He olivat umbrilaisia, jotka asuivat pienissä linnoitetuissa korkealla sijaitsevissa asutuskeskuksissa. Vuodesta 450 eaa. alkaen etruskit valtasivat vähitellen nämä asutukset. Roomalaiset ottivat Keski-Italian haltuunsa Sentinumin taistelun jälkeen vuonna 295 eaa. He rakensivat kukoistavan municipium Asisiumin Monte Subasion terasseille. Assisista löytyy yhä roomalaisia jäänteitä: kaupunginmuurit, Forum (nykyinen Piazza del Comune), teatteri, amfiteatteri ja Minervan temppeli (nykyään Santa Maria sopra Minervan kirkko). Vuonna 1997 löydettiin myös roomalaisen huvilan jäännökset, jotka sisälsivät useita hyvin säilyneitä huoneita, joissa oli freskoja ja mosaiikkeja sellaisessa kunnossa, jota harvoin tavataan Pompeijin kaltaisten paikkojen ulkopuolella.
Vuonna 238 jKr. Assisi kääntyi kristinuskoon piispa Rufinon toimesta, joka sai marttyyrikuoleman Costanossa. Perinteen mukaan hänen jäännöksensä lepäävät San Rufinon katedraalikirkossa Assisissa.
Kuningas Totilan johtamat Pohjolakit tuhosivat suurimman osan kaupungista vuonna 545. Tämän jälkeen Assisi joutui lombardien hallintaan osana lombardien ja sittemmin frankkien Spoleton herttuakuntaa.
Kukoistavasta kunnasta tuli 1100-luvulla itsenäinen ghibellinkunta. Jatkuvassa kamppailussa Perugian guelfien kanssa Francesco di Bernardone (Assisilaisen pyhä Fransiskus) joutui vangiksi eräässä näistä taisteluista, Ponte San Giovannin taistelussa, ja pani liikkeelle tapahtumat, jotka lopulta saivat hänet elämään kerjäläisenä, luopumaan maailmasta ja perustamaan pikkuveljien ritarikunnan.
Roomalaisten muurien sisäpuolella pysytellyt kaupunki alkoi laajentua muurien ulkopuolelle 1300-luvulla. Tänä aikana kaupunki oli paavin tuomiovallan alainen. Rocca Maggiore, kaupungin yläpuolella olevan kukkulan huipulla sijaitseva keisarillinen linnoitus, jonka kansa oli ryöstänyt vuonna 1189, rakennettiin uudelleen vuonna 1367 paavillisen legaatin, kardinaali Gil de Albornozin määräyksestä.
Aluksi Assisi joutui Perugian ja myöhemmin useiden despoottien, kuten onnenpekka Biordo Michelottin, Gian Galeazzo Viscontin ja hänen seuraajansa Francesco I Sforzan, Milanon herttuoiden, Jacopo Piccininon ja Federico II da Montefeltron, Urbinon herran, vallan alle. Kaupunki ajautui syvään rappioon mustan surman aiheuttaman ruton vuoksi vuonna 1348.
Kaupunki joutui jälleen paavin tuomiovallan alaisuuteen paavi Pius II:n (1458-1464) aikana.
Vuonna 1569 aloitettiin Santa Maria degli Angelin basilikan rakentaminen. Renessanssin aikana ja myöhempinä vuosisatoina kaupunki jatkoi rauhallista kehitystään, kuten Bernabein ja Giacobettien 1600-luvun palatsit todistavat.
Nyttemmin monien pyhiinvaellusmatkojen kohteena Assisi liittyy legendassa sen syntyperäiseen poikaan, pyhään Franciscukseen. Lempeä pyhimys perusti fransiskaanijärjestön ja jakaa kunnian Sienan pyhän Katariinan kanssa Italian suojeluspyhimyksenä. Monet, myös ei-kristityt, muistavat hänet luonnon rakastajana (hänen saarnansa lintujen kuulijoille on yksi hänen elämäänsä liittyvistä legendoista).
Assisiaa koetteli kaksi tuhoisaa maanjäristystä, jotka järisyttivät Umbrian maakuntaa syyskuussa 1997. Mutta toipuminen ja restaurointi ovat olleet huomattavia, vaikka paljon on vielä tekemättä. Monille historiallisille kohteille aiheutui valtavia vahinkoja, mutta suurin nähtävyys, Basilica di San Francesco, avattiin uudelleen alle kaksi vuotta myöhemmin.