Kolonniin kaadetaan hartsiliete, kuten DEAE-Sephadex. Käytettävä matriisi on liukenematon ja siihen on kiinnitetty kovalenttisesti varattuja ryhmiä. Näitä varattuja ryhmiä kutsutaan vaihtimiksi, kuten kationi- ja anioninvaihtimiksi. Kun kolonni on asettunut, se esi-ekvibroidaan puskurissa ennen proteiiniseoksen syöttämistä. DEAE-Sephadex on positiivisesti varautunut liete, jolla on sähköstaattisia vuorovaikutuksia negatiivisesti varautuneiden atomien kanssa, jolloin ne eluoituvat myöhemmin kuin positiivisesti varautuneet molekyylit kiinnostuneessa näytteessä. Tätä erottelutekniikkaa käytetään laajalti tiettyjen proteiinien tai elimistön entsyymien löytämiseksi. Sitoutumattomat proteiinit kerätään läpivirtaukseen ja/tai myöhempiin puskuripesuihin. Positiivisesti varautuneeseen hartsiin sitoutuneet proteiinit pidättyvät ja ne voidaan eluoida kahdella tavalla. Ensinnäkin eluointipuskurin suolapitoisuutta nostetaan asteittain. Suolaliuoksen negatiiviset ionit (esim. Cl-) kilpailevat proteiinin kanssa hartsiin sitoutumisesta. Toiseksi liuoksen pH-arvoa voidaan laskea asteittain, jolloin proteiini saa positiivisemman varauksen, jolloin se irtoaa hartsista. Molemmilla näillä tekniikoilla voidaan syrjäyttää negatiivisesti varautunut proteiini, joka sitten eluoidaan koeputkifraktioihin puskurilla.
Proteiinien erottelu riippuu kokonaisvarauksen eroista. Ionisoituvien sivuketjuryhmien koostumus määrittää proteiinin kokonaisvarauksen tietyssä pH:ssa. Isoelektrisessä pisteessä (pI) proteiinin kokonaisvaraus on 0 eikä se sitoudu matriisiin. Jos pH on pI:n yläpuolella, proteiinilla on negatiivinen varaus ja se sitoutuu matriisiin anioninvaihtopylväässä. Proteiinin stabiilisuus pI:n ylä- tai alapuolella määrittää, onko käytettävä anioninvaihtopylvästä vai kationinvaihtopylvästä. Jos proteiini on stabiili pI:n alapuolella olevissa pH-arvoissa, käytetään kationinvaihtokolonnia. Jos se on stabiili pI:n yläpuolella olevissa pH-arvoissa, voidaan käyttää anioninvaihtokolonnia.