Regreso a lo básico – ¿Qué es un inmunoensayo? – Versión descargable en PDF
¿Qué es un inmunoensayo o ELISA?
Los inmunoensayos son pruebas rápidas y precisas que pueden utilizarse in situ y en el laboratorio para detectar moléculas específicas. Los inmunoensayos se basan en la capacidad inherente de un anticuerpo para unirse a la estructura específica de una molécula. Los anticuerpos son proteínas generadas por los animales en respuesta a la invasión de una molécula extraña (antígeno) en el organismo. Los anticuerpos se encuentran en la sangre y en los fluidos tisulares y se unen al antígeno cada vez que lo encuentran. Dado que los anticuerpos se desarrollan en función de la estructura tridimensional específica de un antígeno, o analito, son altamente específicos y se unirán sólo a esa estructura. Una vez purificados de la sangre, los anticuerpos monoclonales y policlonales son reactivos de ensayo ideales para detectar y controlar moléculas objetivo específicas con interferencias limitadas de otras sustancias. Los cuatro formatos típicos de ELISA son: inmunoensayos de anticuerpos en sándwich, inmunoensayos de antígenos hacia abajo, ensayos de inhibición competitiva y ensayos rápidos.
Inmunoensayo de anticuerpos en sándwich
En un inmunoensayo típico de anticuerpos en sándwich, se adsorbe un anticuerpo monoclonal en una placa de microtitulación de plástico. Cuando se añade la muestra a la placa, el anticuerpo de la placa se une al antígeno objetivo de la muestra y lo retiene en la placa. Cuando se añade un anticuerpo policlonal en el siguiente paso, también se une al antígeno diana (ya unido al anticuerpo monoclonal de la placa), formando así un «sándwich» de antígeno entre los dos anticuerpos diferentes.
– Paso 1: Los anticuerpos monoclonales se adsorben en el pozo de una placa de microtitulación de plástico con tampón de recubrimiento (sin añadir muestra).
– Paso 2: Adición de una muestra (como sangre humana, diluida adecuadamente) al pozo de la placa de microtitulación. El antígeno diana se une al anticuerpo adsorbido en la placa, reteniendo el antígeno en el pocillo.
– Paso 3: Unión de un anticuerpo policlonal conjugado con enzimas al antígeno diana (unido al anticuerpo monoclonal de la placa), formando así un «sándwich» de antígeno entre los dos anticuerpos diferentes.
– Paso 4: La adición de un sustrato colorimétrico para la detección de los anticuerpos policlonales conjugados con enzimas generará una señal de color proporcional a la cantidad de antígeno diana presente en la muestra original añadida a la placa.
Inmunoensayo de reducción de antígeno (prueba de inmunidad)
En un inmunoensayo de reducción de antígeno (prueba de inmunidad), el analito se recubre utilizado para unir anticuerpos que se encuentran en una muestra. Cuando se añade la muestra (como el suero humano), el antígeno de la placa se une a los anticuerpos (IgE, por ejemplo) de la muestra, que quedan retenidos en el pocillo. A continuación se añade un anticuerpo específico de la especie (anti-IgE humana, por ejemplo) marcado con HRP, que se une al anticuerpo unido al antígeno de la placa. Cuanto mayor sea la señal, más anticuerpos habrá en la muestra. Los ensayos de reducción de antígeno (prueba de inmunidad) pueden configurarse como pruebas rápidas y se utilizan a menudo para diagnosticar condiciones de alergia – rutinariamente se analiza la sangre de un paciente contra diferentes alérgenos para ver si la persona tiene anticuerpos contra ese alérgeno.
Inmunoensayo de inhibición competitiva
Además del formato de sándwich de anticuerpos monoclonales-policlonales (Mo-Po), muchos inmunoensayos se estructuran en un formato de inhibición competitiva. Los ensayos de inhibición competitiva se utilizan a menudo para medir analitos pequeños porque los ensayos de inhibición competitiva sólo requieren la unión de un anticuerpo en lugar de dos, como en los formatos ELISA estándar. Debido a la alta probabilidad de que se produzca un impedimento estérico cuando dos anticuerpos intentan unirse a una molécula pequeña al mismo tiempo, un formato de ensayo en sándwich puede no ser factible. Por lo tanto, sería preferible un ensayo de inhibición competitiva.
En un ensayo de inhibición competitiva secuencial, la muestra y el analito conjugado se añaden en pasos como un ensayo sándwich, mientras que en un ensayo de inhibición competitiva clásico, estos reactivos se incuban juntos al mismo tiempo. En un formato de ensayo de inhibición competitiva secuencial, se recubre un anticuerpo monoclonal en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Cuando se añade la muestra, el MoAb captura el analito libre de la muestra. En el siguiente paso, se añade una cantidad conocida de analito marcado con biotina o HRP. El analito marcado también intentará unirse al MoAb adsorbido en la placa, sin embargo, el analito marcado es inhibido de unirse al MoAb por la presencia del analito previamente unido de la muestra. Esto significa que el analito marcado no será unido por el monoclonal en la placa si el monoclonal ya ha unido el analito no marcado de la muestra. La cantidad de analito no marcado en la muestra es inversamente proporcional a la señal generada por el analito marcado. Cuanto más baja sea la señal, más analito no marcado hay en la muestra. Se puede construir una curva estándar utilizando diluciones en serie de un estándar de analito no marcado. Los valores posteriores de la muestra pueden leerse a partir de la curva estándar, como se hace en los formatos ELISA tipo sándwich. El formato clásico de ensayo de inhibición competitiva requiere la adición simultánea de analito marcado (conjugado) y no marcado (de la muestra). Tanto el analito marcado como el no marcado compiten entonces simultáneamente por el sitio de unión del anticuerpo monoclonal de captura en la placa. Al igual que en el formato de inhibición competitiva secuencial, la señal coloreada es inversamente proporcional a la concentración de analito objetivo no marcado en la muestra. La detección del analito marcado puede realizarse utilizando un sustrato de peroxidasa como el TMB, que puede leerse en un lector de placas de microtitulación.
Inmunoensayo rápido
Además de las placas de microtitulación, los inmunoensayos también se configuran como pruebas rápidas, como una prueba de embarazo casera. Al igual que los ensayos en placas de microtitulación, las pruebas rápidas utilizan anticuerpos para reaccionar con los antígenos y pueden desarrollarse como formatos de sándwich MoAb-PoAb, formatos de inhibición competitiva y formatos de bajada de antígeno. En una prueba rápida, los reactivos de anticuerpos y antígenos se unen a membranas porosas, que reaccionan con muestras positivas mientras canalizan el exceso de fluidos a una parte no reactiva de la membrana. Los inmunoensayos rápidos suelen presentarse en dos configuraciones: una prueba de flujo lateral en la que la muestra simplemente se coloca en un pozo y los resultados se leen inmediatamente; y un sistema de flujo continuo, que requiere colocar la muestra en un pozo, lavar el pozo y, finalmente, añadir un conjugado de oro analítico-coloidal y el resultado se lee al cabo de unos minutos. Se analiza una muestra por tira o casete. Dado que las pruebas rápidas son más rápidas que los ensayos en placas de microtitulación, requieren poco procesamiento de la muestra, suelen ser más baratas y generan respuestas de sí/no sin utilizar un instrumento, suelen ser utilizadas sobre el terreno por personas que no son de laboratorio para analizar muestras enteras. Sin embargo, los inmunoensayos rápidos no son tan sensibles ni pueden utilizarse para cuantificar con precisión un analito (el autocontrol de los niveles de glucosa en sangre por parte de los diabéticos se considera una prueba rápida cuantitativa, sin embargo, la tecnología de inmunoensayo no se utiliza para estas pruebas). Todas las pruebas rápidas de inmunoensayo pueden convertirse en un ensayo en placa de microtitulación, pero no todos los ensayos en placa de microtitulación pueden convertirse en una prueba rápida.
