La inmunotinción utiliza anticuerpos para detectar un antígeno en células o tejidos. La principal ventaja de la inmunotinción en la inmunohistoquímica (IHC) es la capacidad de ver el objetivo deseado en una muestra de tejido mientras se mantiene el contexto espacial y la arquitectura del tejido.
Tinción de inmunohistoquímica (IHC): Definición breve
Tipos de tinción
La inmunotinción puede realizarse de forma directa o indirecta. La conjugación de nuestros anticuerpos validados para la aplicación con una serie de fluoróforos permite el marcaje directo. Para ver nuestra oferta de conjugados directos, haga clic aquí.
A menudo, según los niveles de expresión del antígeno y la accesibilidad, un conjugado directo no es suficiente para visualizar la diana de interés. En estos casos, se emplea el etiquetado indirecto utilizando un anticuerpo secundario. El método preferido en el CST es utilizar reactivos de detección altamente sensibles, de un solo paso y basados en polímeros, específicos para IgG de conejo o ratón.
Ejemplos de tinción IHC
A continuación se muestran algunos ejemplos de tinción IHC realizados en el CST. Cada uno de los anticuerpos utilizados a continuación ha sido sometido a nuestro riguroso proceso de validación para evaluar con confianza la detección específica del antígeno deseado.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Análisis IHC de carcinoma de pulmón humano embebido en parafina utilizando PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Análisis IHC de carcinoma de pulmón humano embebido en parafina utilizando PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: Análisis IHC de carcinoma de mama humano embebido en parafina utilizando CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: Análisis IHC de carcinoma de mama humano embebido en parafina utilizando CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Análisis IHC de carcinoma endometrioide humano embebido en parafina utilizando α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb realizado en el Leica® Bond™ Rx.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Análisis IHC de carcinoma endometrioide humano embebido en parafina utilizando α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb realizado en el Leica® Bond™ Rx.
¿Cómo se realiza la tinción de inmunohistoquímica (IHC)?
Preparación del tejido
Los procedimientos de recogida, preservación y fijación del tejido varían según la muestra o el objetivo de interés. La recogida y fijación del tejido afecta directamente a la integridad de la muestra y a sus resultados experimentales.
Los fijadores de reticulación, como la formalina, se utilizan a menudo para preparar las muestras para la IHC porque preservan la integridad estructural del tejido, lo que ayuda a mantener la arquitectura del mismo. Otra opción es criopreservar (congelar) sus muestras, lo que puede ser una mejor opción si está intentando detectar una diana fosforilada.
Recuperación de antígenos (epítopos)
Los fijadores utilizados para preservar la integridad estructural de la muestra de tejido también tienen inconvenientes en el sentido de que pueden enterrar el epítopo que su anticuerpo está diseñado para reconocer.
Existen varios métodos para revelar epítopos que han sido enmascarados por la fijación. Entre ellos se encuentra la recuperación de antígenos inducida por proteólisis, que depende de una enzima como la proteinasa K, o la recuperación de epítopos inducida por calor (HIER), que utiliza el calor para romper los enlaces cruzados y desenrollar las proteínas. Cualquiera de los dos métodos puede desenmascarar los epítopos, haciéndolos accesibles al anticuerpo primario y susceptibles de ser teñidos por IHC.
En el CST, nuestro método de recuperación de antígenos más común es el HIER. Sin embargo, nuestros científicos prueban múltiples métodos de recuperación de antígeno para determinar las condiciones óptimas para el uso de cada anticuerpo en IHC. El protocolo recomendado por CST puede encontrarse en la hoja de datos de cualquier anticuerpo validado para IHC.
Unión de anticuerpos
La selección del anticuerpo adecuado es uno de los pasos más críticos para obtener un resultado exitoso en IHC. Todos los anticuerpos validados para IHC de CST se verifican no sólo por tener una fuerte señal en el tejido, sino que se someten a un estricto procedimiento de validación para confirmar la especificidad de la señal. Nuestros científicos, especializados en IHC, prueban un gran número de anticuerpos y sólo recomiendan los más adecuados para la aplicación.
Haga clic aquí para examinar los anticuerpos validados para IHC para su objetivo.
Sistemas de detección
La tinción inmunohistoquímica (IHC) permite dos amplias clases de detección: 1) cromogénica y 2) fluorescente. Para la detección cromogénica, CST recomienda el uso de sistemas basados en polímeros que evitan las limitaciones del sistema basado en biotina al tiempo que aumentan la sensibilidad del ensayo.
Pruebe el reactivo de detección IHC SignalStain® Boost (HRP, conejo) #8114 o el reactivo de detección IHC SignalStain® Boost (HRP, ratón) #8125 dependiendo de la especie huésped de su anticuerpo primario.
La detección basada en polímeros es más sensible que los sistemas basados en biotina. Análisis IHC de carcinoma de pulmón humano embebido en parafina utilizando Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 y detección basada en biotina (izquierda) o detección basada en polímeros (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; derecha). Como se muestra, la detección basada en polímeros ofrece una mayor sensibilidad y resulta en una tinción más robusta.
La detección basada en polímeros es más sensible que los sistemas basados en biotina. Análisis IHC de un carcinoma de pulmón humano embebido en parafina utilizando Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 y detección basada en biotina (izquierda) o detección basada en polímeros (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; derecha). Como se muestra, la detección basada en polímeros ofrece una mayor sensibilidad y resulta en una tinción más robusta.
No todos los sustratos DAB tienen el mismo rendimiento. Análisis IHC de carcinoma de mama humano embebido en parafina utilizando Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. La detección cromogénica se llevó a cabo utilizando SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (izquierda), DAB suministrado por el competidor 1 (centro), o DAB suministrado por el competidor 2 (derecha). Aunque el DAB del competidor 2 produce una señal comparable a la del SignalStain® DAB Substrate Kit, el DAB del competidor 1 produce una señal mucho más débil.
No todos los sustratos DAB tienen el mismo rendimiento. Análisis IHC de carcinoma de mama humano embebido en parafina utilizando Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. La detección cromogénica se llevó a cabo utilizando SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (izquierda), DAB suministrado por el competidor 1 (centro), o DAB suministrado por el competidor 2 (derecha). Aunque el DAB del competidor 2 produce una señal comparable a la del SignalStain® DAB Substrate Kit, el DAB del competidor 1 produce una señal mucho más débil.
Contaminación
Después de la detección de anticuerpos, muchos investigadores prefieren la contratinción del tejido para visualizar la anatomía celular y orientar al observador con respecto a la tinción específica. En el CST, contratinamos nuestras muestras utilizando Hematoxilina #14166, que colorea el núcleo de azul. Al elegir una contratinción, es importante que ésta sea compatible con el cromógeno. Por ejemplo, si el color de la contratinción es demasiado similar al color del cromógeno, la señal del anticuerpo será difícil de reconocer.
Protocolo de tinción de inmunohistoquímica (IHC)
A continuación se presenta un resumen de nuestro protocolo recomendado y se destacan los pasos clave para un experimento exitoso. El objetivo de CST es ayudarle a mejorar sus análisis de IHC proporcionando anticuerpos y reactivos validados que le permitan seguir un protocolo sencillo y específico para cada producto y conseguir resultados reproducibles con una optimización mínima.
Vea el vídeo del protocolo de IHC o visite nuestra página de selección de protocolos.