Entre los mamíferos, la autotomía parece haber evolucionado varias veces, pero es taxonómicamente escasa. La autotomía documentada se limita normalmente a la cola y se produce por la pérdida de la vaina de la cola (falsa autotomía) o por la rotura a través de la vértebra (verdadera autotomía)2,5. Además de la autotomía de la cola, se ha hecho una referencia casual a las especies de mamíferos con piel débil o frágil, aunque aún se desconoce si estos animales son capaces de realizar una autotomía de la piel. Por lo tanto, primero tratamos de investigar la evidencia anecdótica de que dos especies de ratón espinoso africano (Acomys kempi y Acomys percivali) se desprenden fácilmente de partes de su piel como un comportamiento de escape de los depredadores.
Para probar la hipótesis de que A. kempi y A. percivali son capaces de autotomía de la piel, atrapamos individuos en vivo en afloramientos rocosos (kopjes) en el centro de Kenia. Además de los pelos protectores, las especies del género Acomys destacan por la presencia de pelos en forma de espina en el dorso (Fig. 1a, b). La manipulación de ambas especies en el campo confirmó que el movimiento vigoroso a menudo conducía al desgarro de la piel. Los desgarros dieron lugar a grandes heridas abiertas o a la pérdida de piel, desde pequeños trozos hasta zonas que representaban aproximadamente el 60% de la superficie dorsal total (Fig. 1c). Además de la pérdida de tegumentos, ambas especies mostraron autotomía de la vaina de la cola, como se ha informado previamente para otras especies de Acomys, y los individuos fueron capturados a menudo con colas perdidas2. Entre los individuos en cautividad, observamos que las heridas severas de la piel sanaban rápidamente, y el rápido recrecimiento de los pelos espinosos ocultaba totalmente la zona herida (Fig. 1d, e). Los individuos capturados en el campo mostraron una cicatrización similar y, en algunos casos, folículos pilosos en fase anágena (es decir, de crecimiento) que parecían haberse regenerado en las zonas heridas (Fig. 1f).
(a-b)A. kempi (a) y A. percivali (b) poseen pelos rígidos y espinosos en el dorso. (c)A. kempi tras la pérdida de la piel dorsal. (d-e) Formación de costras tras una lesión cutánea de espesor total visible en D3 (d). Las mismas heridas de (d) ya no son visibles en D30 y nuevos pelos espinosos cubren la zona dañada (e). (f) Herida de cicatrización en un ejemplar capturado en el campo que muestra nuevos folículos pilosos dentro del lecho de la herida. Barras de escala = 1 cm.
Para evaluar cómo la piel de Acomys se desgarra tan fácilmente, nos preguntamos si las propiedades mecánicas de la piel de Acomys podrían subyacer a su debilidad observada. Basándonos en experimentos que investigan la autotomía de la piel en gecos3, la piel débil (es decir, la piel que posee propiedades estructurales uniformes que falla o se rompe bajo una carga inducida relativamente baja) puede diferenciarse de la piel frágil (es decir, la piel que posee caracterizaciones morfológicas específicas como un plano de fractura que permite que las capas externas se liberen). Para evaluar la debilidad de la piel, comparamos las propiedades mecánicas de la piel de Acomys y de Mus. Durante la carga mecánica, la piel de Mus mostraba propiedades elásticas antes de romperse, mientras que la piel de Acomys era frágil y comenzaba a desgarrarse poco después de aplicar la carga (Fig. 2a). Obtuvimos las curvas de tensión-deformación de la piel dorsal para determinar la resistencia media a la tracción (σm) y encontramos que la piel de Mus era 20 veces más fuerte que la de Acomys (2,3 MPa ±0,19 y 0,11 MPa ±0,03) (Fig. 2a, b). Por último, calculando la dureza media (W), se necesitó casi 77 veces más energía para romper la piel de Mus en relación con la de Acomys (Fig. 2b). Estos resultados demuestran que la piel de Acomys se desgarra (o se rompe) fácilmente en respuesta a una baja tensión aplicada y proporcionan una base mecánica para la debilidad de su piel.
(a-b) Curvas de tensión-deformación para Mus n=6, A. kempi n=5, A. percivali n=5, representadas hasta la tensión de fallo (a) y para un individuo (b) aproximando la resistencia media a la tracción real (σm) y la tenacidad media (W) (representadas como áreas sombreadas). (c-d) Tinción con tricrómico de Masson de la piel dorsal no herida de M. musculus (c) y A. percivali (d). (e-f) Porcentaje de anexos (por ejemplo, folículos pilosos y glándulas asociadas) en la dermis (sombreado amarillo) de Mus (e) y A. percivali (f). (g) Queratinocitos teñidos con citoqueratina (flecha amarilla) empezando a migrar en pequeñas heridas en D3 en Mus. (h) Heridas completamente reepitelizadas en Acomys en D3. Tiempo después de la lesión en días. WM = margen de la herida. Los recuadros muestran la posición relativa de la herida en el tejido representado. (i-l) Tinción con rojo Picrosirius de pequeñas heridas en Mus (i, k) y A. percivali (j, l). La bifurcación de la tinción de Picrosirius (k, l) diferencia las fibras gruesas de colágeno de tipo I (rojo/naranja) de las fibras finas de colágeno de tipo III (verde). Las fibras de colágeno en Mus son predominantemente de tipo I, están densamente empaquetadas y corren paralelas a la epidermis (k). Las fibras de colágeno en A. percivali son más porosas con una mayor proporción de colágeno tipo III (l). Barras de escala = 100µm.
Para evaluar si las propiedades estructurales de la piel de Acomys contribuían a su debilidad mecánica, examinamos las características celulares de la piel de A. percivali y encontramos que era anatómicamente comparable a la de Mus y otros roedores, aunque con folículos pilosos mucho más grandes (Fig. 2c, d). No encontramos evidencia de un plano de fractura, que es el mecanismo de autonomía de la piel en gecos y eslizones3. Al examinar las fibras de elastina, que aumentan la elasticidad de la piel, encontramos que las tres especies poseían una distribución y abundancia similar de elastina en la dermis y bajo el panículo carnoso (Fig. S1a-f). Probamos si los folículos pilosos más grandes en la piel de Acomys reducían el área dérmica total ocupada por el tejido conectivo examinando la proporción de anexos (p. ej. folículos y glándulas asociadas) dentro de la dermis y encontramos que era mayor en A. percivali (55,61% ±4,28) comparado con M. musculus (43,65% ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (Fig. 2e, f). Estos resultados sugieren que, aunque la estructura tisular básica de la piel de Acomys es similar a la de Mus, el espacio ocupado por los anexos en la dermis reduce el contenido absoluto de tejido conectivo, contribuyendo potencialmente a la disminución de la elasticidad y la menor resistencia a la tracción cuando la piel se somete a tensión6. La falta de un plano de fractura subraya este hallazgo y apoya una diferencia estructural inherente que subyace a la debilidad observada de la piel de Acomys.
Dada su debilidad estructural inherente y su propensión al desgarro, evaluamos la capacidad de Acomys para curar heridas de la piel utilizando heridas de escisión de espesor total (FTE) pequeñas (4 mm) y grandes (1,5 cm). En las heridas de ambos tamaños, la formación de costras y la hemostasia fueron rápidas y, en las heridas grandes, contribuyeron a una reducción del 64% ±3,1 del área de la herida 24 horas después de la lesión (Fig. S2a). Durante la curación sin cicatrices en salamandras terrestres7 y fetos de mamíferos8, el lecho de la herida se reepiteliza en varios días, mientras que una herida de 4 mm en la piel de una rata adulta tarda entre 5 y 7 días en reepitelizarse9. En Acomys, descubrimos que cinco de las seis heridas de 4 mm se habían reepitelizado completamente en el día 3 después de la lesión (D3), mientras que las heridas de Mus no se reepitelizaron tan rápidamente (Fig. 2g, h). Tras la reepitelización, los mamíferos de piel suelta (por ejemplo, roedores, conejos, etc.) dependen principalmente de la contracción para curar sus heridas10. Del mismo modo, observamos altas tasas de contracción, que representaban el 95% del cierre de la herida después de 17 días (Fig. S2a-c). A diferencia de la cicatrización, en la que las fibras de colágeno se organizan en una red densa paralela a la epidermis, durante la cicatrización sin cicatrices las fibras de colágeno adoptan un patrón similar al de la dermis no herida10. Examinando la matriz extracelular (ECM) en D10, observamos cicatrización en Mus mientras que en Acomys, las fibrillas de colágeno estaban menos densamente empaquetadas y contenían una estructura más porosa (Fig. 2i, j). Utilizando el rojo picrosirius encontramos que el colágeno tipo I predominaba en el lecho de la herida en D10 en Mus, mientras que el colágeno tipo III era más abundante en Acomys (Fig. 2k, l). Esta diferencia era aún más pronunciada en las heridas de 1,5 cm (Fig. S3a-b’). En conjunto, estos datos muestran que la rápida reepitelización y la contracción del borde de la herida reducen en gran medida el tamaño de los desgarros cutáneos abiertos en Acomys. Nuestros hallazgos, que la ECM de la herida (1) se deposita lentamente, (2) tiene una configuración porosa, y (3) está dominada por el colágeno de tipo III, sugieren que esta composición favorece la regeneración sobre la fibrosis durante la reparación de la piel en Acomys.
Para probar la capacidad regenerativa del entorno de la herida, tomamos muestras de grandes heridas en cicatrización en busca de evidencia de neogénesis de folículos pilosos y regeneración dérmica. En asociación con la ECM más porosa, observamos la neogénesis folicular de pelos normales y de pelos grandes y espinosos en el lecho de la herida entre D21 y D28 y pudimos distinguir los folículos viejos y grandes cerca de los márgenes de la herida de los folículos recién regenerados dentro del lecho de la herida (Fig. 3a-d y Fig. S3c-e). Los nuevos folículos parecían regenerarse en toda la porción no contraída del lecho de la herida y no sólo en la región central (Fig. 3c y Fig. S3e) y observamos folículos pilosos en regeneración en varias etapas de desarrollo (Fig. 3a-m y Fig. S4a-c). Una población localizada y altamente proliferativa de células epidérmicas impulsa el desarrollo del folículo piloso y observamos un fenómeno similar durante la regeneración del folículo (Fig. 3e y Fig. S4a-c). Para investigar si las redes de señalización embrionarias utilizadas durante el desarrollo del folículo piloso se desplegaron durante la regeneración del mismo, examinamos la queratina-17 (Krt17), que se expresa de forma difusa en la epidermis durante el desarrollo de la piel y se restringe progresivamente a los folículos pilosos en desarrollo11. Tras la reepitelización, KRT17 estaba muy enriquecida en toda la neoepidermis que recubría el lecho de la herida en D14 y, a medida que se formaban nuevos folículos pilosos en el lecho de la herida, KRT17 se restringía al epitelio folicular (Fig. 3f y Fig. S5). Durante la reparación de la herida en Mus, descubrimos que KRT17 también estaba altamente regulado en la epidermis reepitelizada en D14 (Fig. S5) y aunque KRT17 se localizó en algunos queratinocitos basales en la epidermis de Mus en D21, estos lugares no se agregaron en placodas o nuevos folículos pilosos, de modo que KRT17 estaba completamente ausente de la nueva epidermis en D26 (Fig. 3f). La desaparición de KRT17 de los queratinocitos basales en Mus, junto con nuestra observación de la localización continua en nuevas placodas y folículos pilosos en Acomys, sugiere que faltan las señales dérmicas subyacentes necesarias para inducir la formación de placodas en Mus.
(a-d) Los folículos pilosos se regeneran en A. percivali (flechas amarillas) entre D21 y D28 en grandes heridas de la piel. Los días son posteriores a la herida. Los nuevos folículos pilosos (flechas amarillas) están presentes en todo el lecho de la herida (zona de puntos rojos) en D28 (c-d). Las flechas verdes indican los folículos viejos. WM = margen de la herida. (e-k) Los folículos pilosos en regeneración expresan proteínas asociadas al desarrollo y la diferenciación; Ki67 marca el germen piloso proliferante (e), queratina-17 (flechas amarillas) en Acomys, pero está ausente en Mus en D26 (f), LEF1 localizado nuclearmente en las placodas del folículo (g) y más tarde en las células de la papila dérmica (dp) y las células de la matriz circundante (mx) (h), SMAD 1/5/8 fosforilado (como indicador de la señalización de Bmp) en las células germinales epidérmicas (i) y posteriormente en las células de la papila dérmica (dp) y las células de la matriz (mx) de los folículos en regeneración (j), y Sox2 en las células de la papila dérmica (k). Barras de escala = 100 µm, excepto (e) = 50 µm.
Aunque la señal precisa para la formación de los placodos sigue siendo oscura, existe un requisito absoluto para la señalización Wnt durante la formación normal de los folículos12. La localización nuclear de la proteína LEF1 se ha utilizado como indicador de esta señalización inductiva13. Detectamos la acumulación nuclear de LEF1 en las placodas epidérmicas en regeneración, en los fibroblastos dérmicos condensados bajo el germen del pelo y en las células de la papila dérmica y de la matriz (Fig. 3g, h y Fig. S6a). También detectamos la tinción nuclear de LEF1 a niveles bajos en algunos queratinocitos basales no placódicos, mientras que no detectamos LEF1 nuclear en la epidermis durante la cicatrización de la herida en Mus, lo que sugiere que la activación Wnt epidérmica en Acomys puede subyacer parcialmente nuestra observación de la regeneración del folículo piloso (Fig. S6b, c).
La regulación de la señalización canónica de Bmp también juega un papel durante la inducción del folículo piloso y la diferenciación de las poblaciones progenitoras foliculares en el folículo piloso maduro (revisado en14). La fosforilación de los SMADs 1, 5 y 8 (pSMAD1/5/8) es una lectura robusta de la señalización canónica de Bmp. Detectamos pSMAD1/5/8 en niveles bajos durante la inducción del folículo y, posteriormente, en niveles más altos en las células de la papila dérmica y de la matriz en proceso de diferenciación en el bulbo piloso (Fig. 3i, j). Además, detectamos una papila dérmica positiva para SOX2 en algunos folículos pilosos en regeneración, lo que es coherente con su papel en la especificación de varios tipos de pelo durante el desarrollo del folículo piloso del ratón15 (Fig. 3k). En conjunto, estos resultados demuestran que los folículos pilosos regenerados en Acomys progresan a través de etapas definidas de desarrollo del folículo piloso, muestran altas tasas de proliferación y vuelven a desplegar las vías moleculares utilizadas durante el desarrollo del folículo piloso embrionario para regenerar nuevos folículos pilosos.
La piel de los mamíferos adultos es normalmente incapaz de regenerar las estructuras derivadas de la epidermis en respuesta a las heridas (por ejemplo, glándulas y folículos pilosos). Una excepción a esto es la observación de la génesis folicular espontánea en grandes heridas por escisión en conejos, y más recientemente en ratones de laboratorio (C57BL6/SJ, SJL o cepa mixta)16,17,18. Los conejos son también una de las pocas especies de mamíferos capaces de regenerar grandes heridas de perforación de la oreja19. Nuestra hipótesis es que la capacidad de regeneración observada en Acomys podría extenderse también a su tejido auricular. Para comprobarlo, realizamos perforaciones de 4 mm en las orejas de ambas especies de Acomys y, para nuestra sorpresa, descubrimos que eran capaces de cerrar estas grandes perforaciones (Fig. 4a-c y Fig. S7a-c). El tejido de la oreja no lesionado contiene piel (epidermis y dermis), folículos pilosos asociados, células adiposas, músculo y cartílago; encontramos que las Acomys eran capaces de regenerar completamente todos estos tejidos con alta fidelidad, excepto el músculo (Fig. 4b-c). Doce días después de la lesión observamos una acumulación de células alrededor de la circunferencia de la herida por debajo de la epidermis y, aunque la regeneración de nuevo tejido fue centrípeta, las células se acumularon en mayor medida en el lado proximal del punzón. La regeneración del folículo piloso y del cartílago procedió en una onda de proximal a distal (Fig. 4d, e) y, de forma similar a la piel, la epidermis folicular de la oreja activó la señalización Wnt (Fig. S6d, e). En contraste con Acomys, encontramos que Mus fue incapaz de regenerar perforaciones de oreja de 4mm y en su lugar formó tejido cicatricial (Fig. S8a, b). Curiosamente, a pesar de la formación de cicatrices, la reparación de la oreja por Mus dio lugar a la formación de novo de condensaciones de cartílago distales al cartílago cortado, lo que sugiere que Mus podría iniciar, pero no mantener, una respuesta regenerativa tras la herida de la oreja (Fig, S8b).
(a) Pinchazo de 4 mm regenerado en A. percivali. (b) Tejido no herido en el pabellón auricular de Acomys. (c) Dermis regenerada, folículos pilosos, cartílago y tejido adiposo en el área perforada por la biopsia. Los días son posteriores a la lesión. Círculo blanco = área de perforación original. (d) Los folículos pilosos regenerados (flechas amarillas) y el cartílago (flechas verdes) se diferencian de forma proximal a distal. (e) Safranin-O/Fast Green indica condrogénesis (flechas verdes). (f-i) Células proliferantes (Ki67+) en las orejas tempranas (f-g) y tardías (h-i) de Acomys y Mus. La proliferación está restringida a la proximidad de la epidermis de la herida (WE) (flechas rojas) en Acomys (f) y es continua en los queratinocitos basales de Mus (g). La proliferación se mantiene en Acomys a D32 (h) y persisten muy pocas células proliferantes en Mus (i) (flechas rojas). (j-l) La membrana basal madura teñida con colágeno IV está ausente bajo la epidermis de la herida en Acomys (j), pero está presente cerca de la amputación (k) y distalmente en Mus (l). Las flechas amarillas indican la membrana basal; e=epidermis, y los corchetes blancos indican el grosor de la epidermis. (m-n) Casi no hay fibroblastos αSMA positivos en Acomys (m) mientras que los miofibroblastos αSMA positivos están presentes en la oreja de Mus en fase de curación (n). El recuadro muestra las fibras de tensión en miofibroblastos individuales. (o) La TN-C desaparece donde se diferencia el nuevo cartílago (flechas blancas) en Acomys. Las células amarillas/verdes (j-o) son células sanguíneas autofluorescentes en el canal GFP. Barras de escala = 100 µm.
Sigue sin estar claro si la regeneración de los mamíferos procede a través de la formación de un blastema, o es en cambio una versión exagerada del crecimiento hiperplásico20,21,22. La formación de blastema se considera un sello distintivo de la regeneración epimórfica. Una característica de un blastema de regeneración es que contiene células proliferantes y mantiene la proliferación durante la regeneración23. Observamos una proliferación generalizada en toda la oreja regenerada en Acomys y, sorprendentemente, en todo el tejido auricular en curación en Mus (Fig. 4f, g). Sin embargo, observamos una falta de proliferación en la epidermis distal de Acomys, mientras que detectamos proliferación en toda la epidermis de Mus extendiéndose hasta la punta distal (Fig. 4f, g). Mientras que la proliferación se mantuvo en las orejas de Acomys, no observamos casi ninguna célula proliferante en las orejas de Mus en etapas posteriores (Fig. 4h, i).
Una segunda característica de un blastema es la formación de un centro de señalización epidérmico especializado (la epidermis de la herida) que se requiere para que las células proliferantes del blastema permanezcan en el ciclo celular24 y se caracteriza por la pérdida de la estratificación epidérmica, la pérdida de la polaridad de los queratinocitos basales y la falta de una lámina basal madura25. Tras la reepitelización en Acomys, observamos un engrosamiento de la epidermis distal, la desorganización de los queratinocitos basales y la ausencia de una membrana basal madura (Fig. 4j). Comparativamente, la epidermis cercana al plano de amputación mostraba una estratificación normal y poseía una membrana basal prominente (Fig. 4k). Por el contrario, en Mus parecía formarse una epidermis de la herida sólo de forma transitoria tras la reepitelización, con un área distal proporcionalmente más pequeña que mostraba estas características durante un breve periodo de tiempo (datos no mostrados). Para D12 en Mus, la tinción de colágeno tipo IV reveló una membrana basal madura debajo de toda la epidermis de la oreja en curación (Fig. 4l). Además, la epidermis mostraba una estratificación normal y una polaridad apical-basal adecuada de los queratinocitos basales (Fig. 4g, l).
Además de la proliferación sostenida y la formación de la epidermis de la herida, las moléculas de la matriz extracelular (ECM) desempeñan un papel clave en el apoyo a la proliferación y la dirección de la diferenciación posterior durante la regeneración26. Por el contrario, moléculas como la laminina y el colágeno tipo I, que favorecen la diferenciación, se regulan a la baja en el blastema durante la regeneración de las extremidades de los anfibios y se expresan a medida que avanza la diferenciación del sistema musculoesquelético26,27. El examen histológico de las orejas de Acomys en D12 reveló altos niveles de fibronectina (FN), algo de tenascina-C (TN-C) rodeando células densamente empaquetadas, pero niveles muy bajos de colágeno tipo I (Fig. S9a-c). El colágeno tipo III también fue más abundante que el colágeno tipo I durante la regeneración (Fig. S9d-d’). TN-C se restringió de las áreas donde el nuevo cartílago comenzó a diferenciarse y dentro de estas células diferenciadoras encontramos la activación de la vía de señalización Bmp en las células que dan lugar al nuevo cartílago auricular (Fig. 4o y Fig. S10). Durante el crecimiento hiperplásico en las orejas de Mus, la ECM mostró inicialmente altos niveles de FN y bajos niveles de TN-C como las orejas de Acomys, pero produjo niveles relativamente más altos de colágeno tipo I (Fig. S9e-g). La producción de colágeno en Mus no sólo fue más rápida y abundante, sino que también mostró una mayor proporción de colágeno tipo I a III (Fig. S9h, h’). Dada la exuberante producción de colágeno tipo I en Mus, nos preguntamos si los fibroblastos residentes se estaban diferenciando en miofibroblastos, que contribuyen a la cicatrización en lugar de la regeneración (revisado en28). Utilizando actina de músculo liso alfa (αSMA), encontramos miofibroblastos en alta abundancia en todo el tejido del oído en Mus, mientras que estaban casi completamente ausentes en las orejas de Acomys (Fig. 4m, n). Estos datos corroboran la importancia de la MEC de la herida para promover la proliferación mientras antagoniza la diferenciación y apoyan trabajos anteriores que muestran que la formación precoz de colágeno tipo I antagoniza la regeneración del apéndice27.
Nuestros datos sugieren que la regeneración reparadora de la oreja en Acomys es un equilibrio entre la reforma prematura de la dermis (cicatrización) y el mantenimiento de la proliferación celular dentro de un entorno pro-regenerativo. En cambio, en Mus no se forma (ni se mantiene) la epidermis de la herida, lo que coincide con la formación precoz de la membrana basal y la estratificación de la epidermis. Esto conduce a la pérdida de proliferación celular, al aumento de la deposición de colágeno tipo I (en lugar de colágeno tipo III), a la activación de miofibroblastos y, en última instancia, a la formación de cicatrices. Aunque nuestros datos sugieren que la regeneración de las orejas comparte características similares con la formación de blastemas, es crucial comprender las señales moleculares necesarias para organizar y mantener la epidermis de una herida e identificar el linaje de las células regeneradoras para abordar cómo se produce la regeneración en estos animales. Los futuros trabajos que investiguen cómo los Acomys son capaces de controlar la fibrosis arrojarán luz sobre cómo pueden equilibrarse la regeneración y la cicatrización frente a la infección y la inflamación en los mamíferos salvajes y proporcionan un sistema modelo ideal en el que examinar la regeneración epimórfica en los mamíferos.