Ingeniería metabólica de Escherichia coli para la producción de cinamaldehído

Selección de enzimas para la biosíntesis de cinamaldehído

El cinamaldehído puede sintetizarse a partir de l-fenilalanina y su biosíntesis requiere tres reacciones enzimáticas: (i) desaminación de la l-fenilalanina en ácido cinámico por la fenilalanina-amoniátrica liasa (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) ligadura ácido-tiol del ácido cinámico a cinamoil-CoA por la 4-cumarato:CoA ligasa (4CL, EC 6.2.1.12), y (iii) la reducción de cinamoil-CoA a cinamaldehído por la cinamoil-CoA reductasa (CCR, EC 1.2.1.44) (Fig. 1a) . La PAL es una enzima ubicua que puede encontrarse en muchas plantas, hongos y algunas bacterias, y alberga diversas actividades y especificidades según el origen de la enzima . Hemos examinado dos enzimas PAL, una de la planta Arabidopsis thaliana (AtPAL) y otra de la bacteria Streptomyces maritimus (SmPAL), para comprobar su idoneidad para producir ácido cinámico en E. coli. En el caso de la AtPAL, hay cuatro isómeros que incluyen de la AtPAL1 a la AtPAL4, y se ha informado previamente de que la mayoría de ellos (AtPAL1, 2 y 4) tienen una actividad similarmente mayor que la de la AtPAL3 para la l-fenilalanina como sustrato, por lo que seleccionamos la AtPAL1 como representante de la fuente vegetal. Sus constantes cinéticas (Km) son de 68 y 23 μM, respectivamente. Cada enzima PAL marcada con His se produjo en E. coli BL21(DE3) y se purificó siguiendo los procedimientos descritos en «Métodos». Ambas enzimas, AtPAL1 (78 kDa) y SmPAL (56 kDa), se purificaron con éxito (archivo adicional 1: Figura S1). Aunque el nivel de expresión de AtPAL1 no era tan alto que la banda no pudiera verse en los carriles 1 y 2 del SDS-PAGE, la banda de AtPAL1 pudo verse claramente tras la cromatografía en columna de afinidad en el carril 3 en el que se cargó el eluido concentrado. La molaridad equivalente de cada enzima PAL purificada se incubó con la misma cantidad de l-fenilalanina (como sustrato), y el título de producción de ácido cinámico se cuantificó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (archivo adicional 2: Figura S2). Como se muestra en la Fig. 1b, SmPAL mostró una actividad significativamente mayor (21 veces en la reacción a 30 °C y 27 veces en la reacción a 37 °C) que las de AtPAL1.

También examinamos dos enzimas 4CL diferentes, una de Streptomyces coelicolor (ScCCL) y otra de A. thaliana (At4CL), por su idoneidad para convertir el ácido cinámico en cinamaldehído en E. coli. En el caso de At4CL, se sabe que existen 14 isoformas putativas (At4CL1-At4CL14) . Entre las 14 isoformas, At4CL1-3 tienen actividades similares al cinamato mientras que el resto de isoformas no. Por lo tanto, seleccionamos At4CL1 como representante. Además, utilizamos la enzima CCR de A. thaliana (AtCCR1) para la conversión de cinamoil-CoA en cinamaldehído . Cada enzima 4CL (At4CL1 y ScCCL ) se probó en combinación con la enzima CCR de A. thaliana (AtCCR). Todas las enzimas se purificaron con éxito con alta pureza (archivo adicional 1: Figura S1). Para comparar las actividades enzimáticas de At4CL1 y ScCCL, se prepararon dos reacciones, (i) At4CL1 con AtCCR y (ii) ScCCL con AtCCR, y se mezclaron con ácido cinámico como sustrato. Tras incubar a 30 y 37 °C, se analizó el título de cinamaldehído por HPLC. Como se muestra en la Fig. 1c, la combinación de ScCCL y AtCCR dio como resultado un mayor título de producción de cinamaldehído (4,4 veces en la reacción a 30 °C y 10,4 veces en la reacción a 37 °C) que la combinación de At4CL1 y AtCCR. Basándonos en estos resultados, construimos un sistema de biosíntesis de cinamaldehído en E. coli como se describe a continuación, utilizando las siguientes enzimas SmPAL, ScCCL, y AtCCR.

Construcción de la vía de biosíntesis de cinamaldehído en E. coli

Para producir cinamaldehído en E. coli, se clonaron los genes SmPAL, ScCCL, y AtCCR en pTrc99A en el siguiente orden: SmPAL, ScCCL y AtCCR (dando lugar a pHB-CAD) (Fig. 2a). E. coli W3110 que alberga pHB-CAD se cultivó a dos temperaturas diferentes (30 y 37 °C) para encontrar la temperatura óptima para la producción de cinamaldehído. La expresión de las enzimas se analizó mediante SDS-PAGE, seguido de un análisis de western blot como se describe en «Métodos». A ambas temperaturas, todas las enzimas se expresaron bien y fueron altamente solubles (Fig. 2b). Aunque cada enzima se expresó a un nivel diferente, la expresión de cada enzima fue marginalmente mejor a 37 °C que a 30 °C. Además, el análisis del título de cinamaldehído producido en el medio de cultivo mediante HPLC reveló que el título de producción de cinamaldehído era 4,5 veces mayor a 37 °C que a 30 °C (Fig. 2c). Suponemos que el mayor título de producción de cinamaldehído a 37 °C fue causado por un mayor nivel de expresión de todas las enzimas biosintéticas a 37 °C activamente, aunque estas enzimas son activas a 30 °C . En lo sucesivo, todos los cultivos para la producción de cinamaldehído se realizaron a 37 °C.

Ingeniería de cepas para aumentar la reserva intracelular de l-fenilalanina

Para la biosíntesis del cinamaldehído, la l-fenilalanina es necesaria como precursor esencial . Por lo tanto, para mejorar la producción de cinamaldehído, es deseable aumentar la reserva intracelular de l-fenilalanina. Para ello, hemos rediseñado racionalmente E. coli para que produzca más l-fenilalanina. Utilizando la información metabólica y reguladora disponible como guía, diseñamos E. coli W3110 de la siguiente manera (i) deleción del gen crr que codifica la proteína EIIAGlc relacionada con el sistema de fosfoenolpiruvato fosfotransferasa (PTS) específico de la glucosa para moderar la tasa de captación de sustrato, disminuir el desbordamiento de metabolitos y el enriquecimiento de precursores, (ii) deleción del gen tyrR para aliviar la estrecha regulación del regulón TyrR que contiene genes de síntesis de aminoácidos aromáticos (AAA), (iii) deleción de los genes trpE (componente de la antranilato sintasa) y tyrA para evitar la pérdida de flujo de carbono hacia las vías competidoras (biosíntesis de l-triptófano y l-tirosina), y (iv) deleción del gen pykA (piruvato quinasa A) para enriquecer el precursor y equilibrar el flujo entre el crecimiento y la producción de l-fenilalanina (Fig. 3). Basándose en el esquema anterior, se desarrollaron cinco mutantes knockout secuenciales de E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (Tabla 1).

En primer lugar, se inactivó un PTS fosfoenolpiruvato específico de la glucosa mediante la deleción del gen crr en la cepa E. coli W3110, dando lugar a E. coli YHP01. Aunque esto interrumpe el principal sistema de internalización de la glucosa, YHP01 puede seguir creciendo en medios definidos que contengan glucosa como única fuente de carbono porque la PTS específica de la manosa y la galactosa permeasa pueden seguir internalizando la glucosa en el citoplasma. La derivación de la PTS da lugar a una mayor reserva de fosfoenolpiruvato (PEP), que en última instancia facilita la síntesis de l-fenilalanina. A continuación, eliminamos el gen tyrR en la cepa YHP01 para obtener la cepa YHP02. La proteína tyrR es un regulador del regulón TyrR, que contiene ocho genes implicados en la biosíntesis de AAA . Su supresión también puede aumentar la reserva de l-fenilalanina al aliviar la estrecha regulación de los genes relacionados con la síntesis de AAA. A continuación, eliminamos secuencialmente los genes trpE y tyrA empezando por la cepa YHP02, dando lugar a las cepas YHP03 y YHP04, respectivamente. En la vía de biosíntesis de los AAA, se produce un punto de bifurcación final en el que el corismato puede ser convertido en l-fenilalanina, l-triptófano o l-tirosina por las enzimas PheA, TrpE o TyrA, respectivamente. Las deleciones de los genes trpE y tyrA pueden evitar la pérdida de carbono en las vías competidoras para la biosíntesis de l-triptófano y l-tirosina. Por último, eliminamos el gen pykA en la cepa YHP04 para obtener la cepa YHP05. El gen pykA codifica la piruvato quinasa A (PykA), que constituye el segundo paso de consumo de PEP. Al suprimir el gen pykA, se puede utilizar más PEP en la vía del shikimato y, en consecuencia, se puede producir más cantidad de l-fenilalanina. En cada cepa (YHP01-YHP05), la supresión de los genes se verificó mediante PCR y electroforesis en gel de agarosa (archivo adicional 3: Figura S3).

Todas las cepas de E. coli modificadas, incluyendo YHP01-YHP05 y la E. coli parental W3110, se cultivaron en frascos con agitación que contenían medios semidefinidos, y se comparó el crecimiento celular y la producción de l-fenilalanina. Tras 48 horas de cultivo, todas las cepas modificadas crecieron ligeramente mejor que la cepa W3110; en particular, la cepa E. coli YHP05 mostró la mayor densidad celular (Fig. 4a). En un estudio anterior también se observó que la inactivación de las isozimas PTS y Pyk aumentaba el flujo de carbono hacia la formación de biomasa debido al efecto de conservar cantidades reducidas de metabolitos intermedios resultantes de la disminución de la captación de glucosa y del catabolismo . También analizamos el título de producción de l-fenilalanina en el sobrenadante del cultivo mediante HPLC. En la cepa parental W3110, el título de producción de l-fenilalanina era de 0,24 g/L, pero el título de l-fenilalanina aumentó gradualmente en las cepas de E. coli modificadas (Fig. 4a). E. coli YHP05, en la que se eliminaron los genes crr, tyrR, trpE, tyrA y pykA, mostró el mayor título de producción de l-fenilalanina (0,52 g/L), que era 2,2 veces mayor que el de la E. coli parental W3110. Por lo tanto, decidimos utilizar la cepa E. coli YHP05 para su posterior ingeniería.

Sistema de sobreexpresión basado en plásmidos para aumentar la reserva intracelular de l-fenilalanina

A partir de la cepa E. coli YHP05, la producción de l-fenilalanina se mejoró aún más mediante la sobreexpresión genética basada en plásmidos. La inhibición por retroalimentación en la vía de síntesis de la l-fenilalanina por el shikimato y la l-fenilalanina se redujo mediante la sobreexpresión de isozimas o la introducción de mutaciones en las enzimas implicadas en la vía del shikimato de la siguiente manera (i) sobreexpresión del gen de la 3-deoxi-d-arabinoheptulosonato 7-fosfato (DAHP) sintasa que está codificado en aroG con ingeniería (AroG8/15), (ii) sobreexpresión de los genes ydiB y aroK que codifican la shikimato deshidrogenasa y la shikimato quinasa para aumentar el flujo de carbono en la vía del shikimato, (iii) sobreexpresión del gen pheA que codifica la CHA mutasa/prefenato deshidratasa con ingeniería para mejorar la afinidad de unión al sustrato (PheAfbr, dm), y (iv) sobreexpresión de los genes galP (galactosa permeasa) y glk (glucoquinasa) para facilitar la captación de glucosa (archivo adicional 4: Figura S4).

Primero, para aliviar la inhibición por retroalimentación, se construyó el plásmido pTac15kG, que contenía el gen aroG8/15 diseñado. AroG es la principal enzima implicada en la síntesis de DAHP, pero AroG es completamente inhibida por la l-fenilalanina (tan baja como 0,1 mM) . Se sabe que la introducción de dos mutaciones (D146N y A202T) dio lugar a una resistencia a la inhibición por retroalimentación sin afectar a su elevada actividad específica (AroG8/15) , por lo que sobreexpresamos esta enzima mutante AroG8/15. A continuación, se construyeron dos plásmidos (pTac15kGB y pTac15kGBK) para sobreexpresar los genes ydiB y aroK junto con el gen aroG8/15, respectivamente. El flujo metabólico hacia la vía del shikimato puede aumentar cuando se sobreexpresan la shikimato deshidrogenasa (YdiB) y la shikimato quinasa (AroK). También se construyó posteriormente el plásmido pTac15kGBKA para sobreexpresar el gen pheA que codifica la corismato mutasa/prefenato deshidratasa con mutaciones. En esta construcción, amplificamos sólo los primeros 300 aminoácidos de la PheA de tipo salvaje (PheAfbr), lo que excluye el dominio regulador; por lo tanto, la PheAfbr está débilmente influenciada por la inhibición por retroalimentación. Además, dado que PheAfbr tiene un valor de Km más alto que la PheA de tipo salvaje, lo que refleja su menor afinidad de unión al sustrato, introdujimos dos mutaciones (E159A y E232A) en PheAfbr para mejorar su afinidad de unión al sustrato, dando lugar a PheAfbr, dm . Por último, se construyó el plásmido pYHP para sobreexpresar adicionalmente los genes galP y glk, que codifican la galactosa permeasa y la glucoquinasa, respectivamente. Ambas enzimas facilitan la captación de glucosa .

Tras la construcción de cinco plásmidos, incluyendo pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, y pYHP (Tabla 1), cada plásmido se transformó en E. coli YHP05. Tras un cultivo de 48 h en matraces con agitación que contenían medios semidefinidos, se analizó el crecimiento celular y el título de producción de l-fenilalanina. Todas las células crecieron bien, y en particular E. coli YHP05 que albergaba pYHP creció hasta una densidad celular marginalmente mayor (OD600 = 9,76) que las demás (Fig. 4b). También analizamos el título de producción de l-fenilalanina en el sobrenadante del cultivo mediante HPLC. La sobreexpresión del gen aroG8/15 (pTac15kG) dio lugar a un aumento significativo de la producción de l-fenilalanina (2,25 g/L) en comparación con YHP05 que no albergaba ningún plásmido (0,52 g/L) (Fig. 4b). La sobreexpresión posterior de otros genes dio lugar a un aumento en serie del título de producción de l-fenilalanina y, E. coli YHP05 que alberga pYHP exhibió el mayor título de producción de l-fenilalanina (3,91 g/L) (Fig. 4b). El efecto del plásmido pYHP dio lugar a un aumento significativo de la producción de l-fenilalanina hasta 16,4 veces y 7,5 veces, respectivamente. En el cultivo de E. coli YHP05 con el plásmido pYHP, el rendimiento de l-fenilalanina en glucosa y la productividad fueron de 0,270 g/g y 0,082 g/L/h, respectivamente (archivo adicional 5: figura S5). Por lo tanto, en la E. coli YHP05 de ingeniería que alberga pYHP, la reserva de l-fenilalanina se mejoró significativamente. Liu et al. informaron previamente de la producción de l-fenilalanina en E. coli hasta 47 g/L . Sin embargo, ese récord se pudo alcanzar en el cultivo por lotes alimentados (escala de 15 L) y emplearon la coexpresión del transportador de l-fenilalanina (YddG) para la producción eficiente de l-fenilalanina en el medio de cultivo. En nuestro trabajo, no introdujimos el YddG porque el objetivo final de nuestro trabajo no era la producción de l-fenilalanina sino la producción de cinamaldehído. Aunque el título de l-fenilalanina conseguido en nuestro trabajo no era el récord, pensamos que era lo suficientemente alto para la producción de cinamaldehído. Por lo tanto, decidimos utilizar esta cepa de ingeniería para la producción de cinamaldehído.

Producción de cinamaldehído en la E. coli de ingeniería

Usando la E. coli de ingeniería YHP05 que alberga pYHP, primero examinamos la producción de ácido cinámico. Para este experimento, se construyó el plásmido pHB-CA, que contiene el gen SmPAL bajo el promotor trc inducible por IPTG (Tabla 1). E. coli YHP05 que albergaba tanto pHB-CA como pYHP se cultivó en frascos durante 48 horas y se analizó el título de producción de ácido cinámico. También se examinaron como controles E. coli YHP05 y E. coli W3110 que albergaban pHB-CA (sin pYHP). Los patrones de crecimiento de todas las células fueron similares (Fig. 5a) y, E. coli W3110 y YHP05 que albergan pHB-CA produjeron 79 y 108 mg/L de ácido cinámico, respectivamente (Fig. 5b). E. coli YHP05 que alberga tanto pHB-CA como pYHP mostró un título de producción significativamente mejor (287 mg/L), que fue 3,6 veces y 2,7 veces mayor que los de E. coli W3110 y YHP05 que alberga pHB-CA, respectivamente (Fig. 5b). Hasta donde sabemos, este título de producción fue también 1,5 veces mayor que el nivel más alto (186 mg/L) registrado en E. coli . Este resultado indica claramente que la elevación de la cantidad de l-fenilalanina en la cepa de E. coli modificada contribuye positivamente a aumentar la producción de ácido cinámico.

Como objetivo principal, examinamos la producción de cinamaldehído en la cepa de ingeniería E. coli YHP05, que fue transformada con pHB-CAD y pYHP. También se examinaron como controles E. coli YHP05 y E. coli W3110 que albergaba pHB-CAD (sin pYHP). El crecimiento de las células fue similar (Fig. 6a), y las tres enzimas biosintéticas de cinamaldehído se expresaron bien en todas las células examinadas (archivo adicional 6: Figura S6). Tras el cultivo en frasco durante 48 h, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se determinaron los títulos de producción de cinamaldehído mediante HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) y E. coli YHP05 (pHB-CAD) mostraron títulos de producción de cinamaldehído tan altos como 2,18 y 6,3 mg/L, respectivamente (Fig. 6b). Por el contrario, E. coli YHP05 (pHB-CAD y pYHP) mostró un título de producción significativamente mayor (75 mg/L), que fue 35 veces superior al de E. coli W3110 (pHB-CAD).

Actividad nematicida del cinamaldehído producido por E. coli de ingeniería

Para evaluar la actividad nematicida del cinamaldehído producido en el medio de cultivo, se trataron nematodos, B. xylophilus, con cinamaldehído siguiendo los procedimientos descritos en «Métodos» . El sobrenadante de cultivo de E. coli YHP05 que alberga pYHP y pHB-CAD se diluyó hasta que la concentración final de cinamaldehído fue de 60 mg/L, y los nematodos fueron tratados con el sobrenadante de cultivo diluido. Después de 1 y 4 h, sólo el 26% y menos del 18% de los nematodos sobrevivieron, respectivamente (Fig. 7). Como control positivo, los nematodos fueron tratados con cinamaldehído comercialmente disponible y purificado a una concentración equivalente (60 mg/L). Después de 4 h, casi todos los nematodos (95 %) murieron. Estos resultados indicaron que las actividades nematicidas eran similares entre el cinamaldehído comprado comercialmente y el producido en este estudio. Como control negativo, también se probó el sobrenadante de cultivo de E. coli W3110 y, como era de esperar, casi todos los nematodos sobrevivieron (>92 %) después de 4 h.