Resultados y discusión
Dos modos de escisión del ADN por R.KpnI en presencia de Mg2+.
R.KpnI es una REasa altamente promiscua en reacciones catalizadas por Mg2+ a diferencia de la mayoría de las otras REasas (11, 12). En la Fig. 1 A, se muestra el patrón de escisión característico de R.KpnI en un rango de concentraciones de Mg2+. A concentraciones más bajas del ion metálico (50-500 μM), sólo se observó la escisión de la secuencia cognada (carriles 2-5). Sin embargo, a concentraciones de Mg2+ >500 μM, la escisión promiscua fue evidente (carriles 6-9). Los modos específico y promiscuo de escisión por R.KpnI en función de la concentración de Mg2+ se corroboraron mediante el análisis de la escisión de oligonucleótidos. El sustrato de oligonucleótidos que contiene la secuencia canónica fue escindido eficientemente por R.KpnI incluso a 20 μM de Mg2+. Por el contrario, las secuencias no canónicas fueron escindidas eficientemente sólo a >500 μM de Mg2+. Estos resultados implican que R.KpnI presenta dos perfiles de activación de metales diferentes: uno para sustratos de ADN canónicos y otro para los no canónicos. La enzima sigue un perfil de activación metálica hiperbólico para el sustrato canónico y un patrón sigmoidal para el sustrato no canónico (Fig. 1 B). Estos datos fueron sometidos a un análisis de Hill plot (Fig. S2; y ver SI Text ), y el coeficiente de Hill para la unión de iones metálicos se presenta en la Tabla 1. El análisis de Hill plot reveló la unión de un ion metálico adicional a la enzima y su papel en la escisión de secuencias no canónicas. Así, el reclutamiento de un ion metálico adicional cerca o lejos del sitio activo de la enzima parecía ser necesario para inducir la escisión promiscua por parte de la enzima. Si este es el caso, la mutación de los residuos implicados en la coordinación del segundo sitio de iones metálicos debería abolir la actividad promiscua, dando lugar a una enzima altamente específica de la secuencia. Probamos esta hipótesis.