Uno de los procedimientos más importantes en virología es la medición del título del virus, es decir, la concentración de virus en una muestra. Un método muy utilizado para determinar la cantidad de virus infecciosos es el ensayo en placa. Esta técnica se desarrolló por primera vez para calcular los títulos de los stocks de bacteriófagos. Renato Dulbecco modificó este procedimiento en 1952 para utilizarlo en virología animal, y desde entonces se ha utilizado para determinar de forma fiable los títulos de muchos virus diferentes.
Para realizar un ensayo en placa, se preparan diluciones de 10 veces de un stock de virus y se inoculan alícuotas de 0,1 ml en monocapas de células susceptibles. Tras un periodo de incubación, para permitir que el virus se adhiera a las células, las monocapas se cubren con un medio nutritivo que contiene una sustancia, normalmente agar, que provoca la formación de un gel. Cuando se incuban las placas, las células infectadas originales liberan progenie viral. La propagación de los nuevos virus está restringida a las células vecinas por el gel. En consecuencia, cada partícula infecciosa produce una zona circular de células infectadas llamada placa. Con el tiempo, la placa se hace lo suficientemente grande como para ser visible a simple vista. A menudo se utilizan colorantes que tiñen las células vivas para aumentar el contraste entre las células vivas y las placas. Sólo los virus que causan daños visibles en las células pueden ser analizados de esta manera. A la izquierda se muestra un ejemplo de placas formadas por poliovirus en una monocapa de células HeLa. En esta imagen, las células se han teñido con violeta de cristal, y las placas son fácilmente visibles donde las células han sido destruidas por la infección viral.
El título de un stock de virus puede calcularse en unidades formadoras de placas (PFU) por mililitro. Para determinar el título del virus, se cuentan las placas. Para minimizar el error, sólo se cuentan las placas que contienen entre 10 y 100 placas, dependiendo del tamaño de la placa de cultivo celular que se utilice. Los principios estadísticos dictan que cuando se cuentan 100 placas, el título de la muestra variará en más o menos un 10%. Cada dilución se coloca por duplicado para mejorar la precisión. En el ejemplo que se muestra a continuación, hay 17 placas en la placa hecha con la dilución 10-6. El título del stock de virus es, por tanto, de 1,7 x 108 PFU/ml.
A continuación consideraremos cómo puede utilizarse el ensayo de placas para preparar stocks de virus clonales, un paso que es esencial para estudiar la genética viral.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Algunos problemas de virología animal estudiados por la técnica de la placa. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279