La determinación de compuestos traza orgánicos en el análisis de alimentos es de gran importancia para los aspectos de calidad y seguridad alimentaria. Tanto la separación del analito de las posibles inferencias en la matriz alimentaria, como la determinación cualitativa y cuantitativa del compuesto objetivo, son pasos vitales en la química analítica de los alimentos.
Definición
La cromatografía líquida (LC, aquí LC de alto rendimiento – HPLC) es una técnica de separación física para el análisis de trazas. Se basa en la interacción de un analito con una fase estacionaria (columna con partículas) y una fase móvil (eluyente líquido o una mezcla de eluyentes). La espectrometría de masas (EM) es la herramienta analítica para medir la composición de una muestra. La EM genera información útil sobre el peso molecular y la estructura de los analitos y ayuda en la elucidación de compuestos desconocidos.
La combinación, LC/MS, LC-MS es una técnica poderosa, debido a su muy alta sensibilidad (hasta el rango de ppt) y especificidad. En el ámbito del análisis de trazas orgánicas, la EM se utiliza para muchas aplicaciones, pero a diferencia de la CG/EM (Cromatografía de Gases, acoplada a la Espectrometría de Masas), se dedica al análisis de muestras que contienen objetivos analíticos no volátiles, normalmente con una masa entre 200 – 800u, que son térmicamente lábiles, presentan una alta polaridad o tienen una masa molecular elevada.
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Principio de funcionamiento
En principio, un dispositivo LC/MS tiene que realizar los cuatro pasos de trabajo, que incluyen:
- Separación cromatográfica de los analitos mediante una columna de separación
- Ionización del analito
- Aislamiento de los iones y
- Identificación de los iones
En general, no es trivial interconectar un sistema HPLC con un espectrómetro de masas, ya que la dificultad consiste en transformar un soluto en un ion en fase gaseosa. El reto consiste en eliminar el disolvente manteniendo un nivel de vacío adecuado en el espectrómetro de masas y en generar los iones en fase gaseosa. Por lo tanto, los componentes que eluyen de la columna cromatográfica se introducen en el espectrómetro de masas a través de una interfaz especializada.
Los dos sistemas de interfaz de ionización más utilizados, la ionización química a presión atmosférica (APCI) y la ionización por electrospray (ESI) se eligen en función de las propiedades fisicoquímicas de los analitos (es decir, la polaridad y la acidez). La ionización tiene lugar a presión atmosférica y ambos se consideran un método de ionización suave, es decir, el espectro de masas proporciona principalmente la información del peso molecular, a menos que se utilicen técnicas de fragmentación.
Dado que los compuestos coeluyen parcialmente del sistema cromatográfico, la asignación clara de los fragmentos individuales no puede llevarse a cabo utilizando únicamente la LC-MS, donde sólo se dispone de las masas de los iones moleculares. Para superar este problema, hoy en día se utiliza principalmente la espectrometría de masas en tándem (MS/MS), que implica múltiples pasos de selección o análisis de masas (LC/MS/MS o LC/MSn). Estos sistemas son capaces de determinar residuos en el rango inferior de ppt. Para la cualificación de las moléculas orgánicas, es necesaria una configuración técnica de EM diferente. Un posible enfoque para la cualificación es el uso de una EM que genera iones, los conduce a una trampa de iones lineal y luego los almacena en un campo de radiofrecuencia. A partir de ahí, diferentes posibilidades técnicas permiten la cualificación de los iones y, por tanto, del compuesto desconocido.
Aplicaciones
Desde su introducción en el análisis de rutina hace unos diez años, la LC/MS se ha establecido en la mayoría de las áreas de la química analítica, por ejemplo, el control de calidad, la investigación fundamental y aplicada y el control gubernamental.
Los siguientes ejemplos proporcionan una breve visión general:
a) Farmacia
- Estudios farmacocinéticos de productos farmacéuticos, por ejemplo, procesos de degradación de fármacos
- Desarrollo de fármacos, por ejemplo. identificación de metabolitos o de impurezas
b) Biología molecular
- Proteómica, por ejemplo, estudio a gran escala de las proteínas, en particular de sus estructuras y funciones
- Metabolómica, por ejemplop. ej. determinación de intermediarios metabólicos, hormonas y otras moléculas de señalización
c) Medio ambiente
- Aguas residuales, p. ej. compuestos endocrinos
- Suelos, por ejemplo, organometálicos
d) Alimentos
- Ingredientes, por ejemplo, aminoácidos, lípidos
- Contaminantes, por ejemplo análisis multirresiduos de plaguicidas, toxinas marinas, residuos veterinarios, determinación de colorantes, acrilamida, análisis de microcistinas
- Productos naturales, p. ej. terpenos, esteroides
Tensioactivos perfluorados (PFC) como ejemplo en el análisis de alimentos
Antecedentes
Los PFC son un excelente ejemplo para combinar la preparación de muestras complejas con sofisticados dispositivos LC/MS y un profundo conocimiento en química analítica. Las propiedades únicas de los PFT los hacen útiles en una serie de productos industriales y comerciales, como los fluidos refrigerantes, los polímeros y como componentes en productos farmacéuticos y pesticidas. En particular, los carboxilatos perfluorados (por ejemplo, el ácido perfluorooctanoico (PFOA)) y los sulfonatos perfluorados (por ejemplo, el ácido perfluorooctansulfónico (PFOS)) se utilizan como tensioactivos, por ejemplo, para impregnar textiles y alfombras, en espumas contra incendios y para tratamientos antigrasa en la industria papelera. El PFC se produce desde hace más de 50 años y se distribuye en todo el mundo. Si los enlaces C-H no se sustituyen totalmente por enlaces C-F, uno de los enlaces químicos más fuertes que se conocen, la degradación sigue siendo posible.
Sólo el PFOA y el PFOS están evaluados toxicológicamente (tóxicos crónicos y cancerígenos), todos los demás compuestos homólogos, isómeros, etc. aún no están evaluados. Desde un punto de vista físico, los PFC son tanto persistentes (es decir, no son degradables) como móviles (es decir, pueden filtrarse desde los suelos contaminados hasta las aguas subterráneas). Esto representa una amenaza permanente en el contexto de la captación y/o acondicionamiento del agua potable. Además, las transferencias de plantas introducen estos compuestos en la cadena alimentaria.
Los descubrimientos de altos niveles de contaminación por PFC en dos ríos alemanes en 2006 atrajeron el interés público hacia estos compuestos.
La contaminación de 2006 puede haber tenido su origen en los lodos orgánicos, aplicados como fertilizantes para fines agrícolas. Se demostró que el suelo contiene hasta 600 µg de PFC/kg, lo que provocó la contaminación del agua potable y de las plantas de suministro. Hasta ahora, siete estados federales alemanes han informado de la contaminación por PFC.
Fraunhofer IME
Una de las competencias principales del Instituto Fraunhofer de Biología Molecular y Ecología Aplicada es el desarrollo de métodos viables y fiables para la identificación y el análisis de contaminantes químicos en matrices alimentarias y medioambientales.
Desde 1999, el Fraunhofer IME ha llevado a cabo proyectos para medir la contaminación por PFC en diversas matrices medioambientales. Este trabajo se ha llevado a cabo en nombre de socios industriales, y se ha centrado especialmente en los PFC-carboxilatos y los PFC-sulfonatos. Se llevaron a cabo otras investigaciones en nombre del Programa de Vigilancia del Banco Federal de Muestras Ambientales de Alemania, que también incluyeron muestras de sangre humana. En 2005, se llevaron a cabo las primeras investigaciones en el ámbito de los productos alimentarios y, en 2006, los resultados de muestras alimentarias seleccionadas (por ejemplo, leche materna, patatas fritas) también se comentaron en los medios de comunicación. En 2007 se llevaron a cabo proyectos de mayor envergadura centrados en la transferencia de plantas, patatas y productos, matrices humanas (sangre y leche materna), así como muestras medioambientales (por ejemplo, aguas residuales, lodos y suelos).
Solución analítica
Se aplicaron tres preparaciones de muestras diferentes para cubrir todas las matrices de muestras posibles:
- IPE (Ion pair extraction). Uso del agente de emparejamiento iónico tetra-n-butilamonio hidrogensulfato seguido de una extracción sólida líquida (por ejemplo, muestras ambientales)
- AAE (extracción ácido-alcalina). Extracción de los lípidos con hexano a pH 14 (solución líquida de amoníaco), ajuste a pH 1 con ácido clorhídrico y extracción con tert-butil metil éter (por ejemplo, leche materna)
- SPE (extracción en fase sólida, el método más citado en la actualidad) con cartuchos de diferente polaridad en función del carácter iónico del PFC en un medio tamponado (p.p. ej. patata)
Se recomienda encarecidamente el uso de estándares internos para la calibración; actualmente, nuestros métodos incluyen nueve estándares de PFC etiquetados en masa. Antes de introducir las muestras en el LC/MS, hay que comprobar que el propio aparato no tenga piezas de recambio recubiertas de teflón, ya que contienen PFC emisores que influirán en los resultados de forma no reproducible. Estas piezas tienen que ser sustituidas, lo que requiere un conocimiento superior de los componentes del LC/MS.
Ejemplo analítico
Para los análisis de patata cruda y productos de patata, ajustamos nuestro LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 con Quattro Ultima Pt en modo Electrospray negativo, ambos Waters; Columna 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2), Phenomenex) para las masas objetivo de 9 ácidos perfluorocarboxílicos (C4 – C12) y 3 ácidos perfluorosulfónicos (C4, C6, C8) utilizando materiales de referencia marcados con 13C (LOQ 0.5 µg/Kg) tras la preparación de una muestra con SPE.
Los PFCs mostraron una distribución diferente en la patata cruda y en los productos de patata, (Tabla 1) lo que permite suponer una contaminación durante el procesado, así como una contaminación del suelo. Esto puede apoyarse en nuestras investigaciones de 2006 sobre los PFC en las patatas fritas, en las que analizamos patatas fritas procedentes de restaurantes de comida rápida y encontramos hasta 2,8 µg de PFOA/kg y hasta 0,9 µg de PFOS/kg.
Perspectivas analíticas
El Fraunhofer IME cuenta con importantes conocimientos y experiencia en el análisis de los PFC, que podrían aplicarse a muchas áreas de la contaminación de los PFC en el medio ambiente y los alimentos que aún no se han investigado. Las áreas importantes para la investigación futura de PFC pueden incluir el aumento del número de analitos, muchos PFC de cadena corta y larga ya están incluidos en nuestro programa de estudio, pero nuestra capacidad analítica podría mejorarse incluyendo PFC adicionales. Los PFC adicionales tienen que ser identificados por LC/MS porque los estándares comerciales no están disponibles. Esto permitirá consolidar los hallazgos de los precursores, las vías de contaminación alimentaria y la degradación durante el procesamiento de los alimentos.
