Se vierte una suspensión de resina, como DEAE-Sephadex, en la columna. La matriz que se utiliza es insoluble con grupos cargados que están unidos covalentemente. Estos grupos cargados se denominan intercambiadores, como los intercambiadores de cationes y aniones. Después de que se asiente, la columna se preequilibra en tampón antes de aplicar la mezcla de proteínas. El DEAE-Sephadex es una pasta cargada positivamente que tendrá interacciones electrostáticas con los átomos cargados negativamente, haciendo que eluyan más tarde que las moléculas cargadas positivamente de la muestra interesada. Se trata de una técnica de separación muy utilizada para descubrir proteínas específicas o enzimas en el organismo. Las proteínas no unidas se recogen en el flujo y/o en los lavados posteriores del tampón. Las proteínas que se unen a la resina cargada positivamente son retenidas y pueden ser eluidas de dos maneras. En primer lugar, se aumenta gradualmente la concentración de sal en el tampón de elución. Los iones negativos de la solución salina (por ejemplo, Cl-) compiten con la proteína para unirse a la resina. En segundo lugar, se puede disminuir gradualmente el pH de la solución, lo que da lugar a una carga más positiva en la proteína, liberándola de la resina. Ambas técnicas pueden desplazar la proteína cargada negativamente que luego se eluye en fracciones de tubos de ensayo con el tampón.
La separación de las proteínas dependerá de las diferencias en la carga total. La composición de los grupos de cadenas laterales ionizables determinará la carga total de la proteína a un pH particular. En el punto isoeléctrico (pI), la carga total de la proteína es 0 y no se unirá a la matriz. Si el pH es superior al pI, la proteína tendrá una carga negativa y se unirá a la matriz en una columna de intercambio aniónico. La estabilidad de la proteína a valores por encima o por debajo del pI, determinará si se debe utilizar una columna de intercambio de aniones o de cationes. Si es estable a valores de pH inferiores al pI, se utilizará la columna de intercambio catiónico. Si es estable a valores de pH por encima del pI, puede utilizarse la columna de intercambio aniónico.