DISCUSIÓN
Citrobacter es una causa importante de infecciones oportunistas; C. diversus se asocia con aproximadamente el 40% de los casos que se presentan, mientras que C. freundiirepresenta aproximadamente el 29% (11). Las Citrobacterspp. causan meningitis neonatal y tienen una propensión inusual a causar abscesos cerebrales (8, 14). La patogénesis de las Citrobacter spp. que causan meningitis y abscesos cerebrales no está bien caracterizada; sin embargo, al igual que con otras bacterias causantes de meningitis, debe producirse la penetración de la barrera hematoencefálica. El presente estudio se realizó para comprender mejor las posibles interacciones de Citrobacter con la barrera hematoencefálica. Se eligió C. freundii como bacteria modelo para estos estudios porque la genética bacteriana está mejor definida y se dispone de una biblioteca genómica para eventuales estudios sobre las bases moleculares de la invasión y replicación de Citrobacter en HBMEC. Los experimentos realizados con un aislado de líquido cefalorraquídeo de C. diversus arrojaron resultados similares (datos no mostrados), lo que sugiere que la frecuencia y el mecanismo de invasión de HBMEC para estas dos especies pueden ser similares.
La barrera hematoencefálica es una estructura compleja que consiste en el epitelio del plexo coroideo y el endotelio capilar cerebral. La presencia de uniones estrechas y la escasa actividad pinocitótica de las células endoteliales da lugar a la restricción del paso de macroelementos a través de la barrera hematoencefálica. En este momento, no se sabe en qué parte de la barrera hematoencefálica penetra C. freundii, pero se descubrió que el plexo coroideo estaba raramente implicado en el modelo de rata infantil de meningitis hematógena experimental por Citrobacter (16). Además, las células microvasculares endoteliales cubren la mayor superficie de la barrera hematoencefálica, y se ha demostrado que otras bacterias causantes de meningitis invaden las células endoteliales microvasculares in vitro (13, 20, 25). Por lo tanto, seleccionamos las HBMEC para nuestro estudio. Los ensayos de invasión en cultivos de tejidos y los estudios de TEM proporcionaron pruebas de que C. freundii invade las HBMEC. Los resultados de los ensayos de invasión realizados en presencia de varios inhibidores celulares eucariotas sugieren que la invasión de C. freundii en HBMEC es un proceso dependiente de los microfilamentos, los microtúbulos, la síntesis de proteínas de novo y la acidificación del endosoma. Los ensayos de invasión prolongada determinaron que C. freundii puede sobrevivir y replicarse intracelularmente durante períodos prolongados in vitro. Los análisis de TEM revelaron que la ubicación intracelular de las células individuales y múltiples de C. freundii se encuentra dentro de estructuras de membrana única similares a vacuolas. Los experimentos de transwell demostraron que C. freundii podía atravesar una monocapa polarizada de HBMEC, mientras que E. coli no podía hacerlo. Además, nuestros datos preliminares muestran que C. freundii penetra la barrera hematoencefálica en el modelo de rata neonatal de meningitis hematógena experimental (21). En conjunto, estos hallazgos sugieren que C. freundii invade las vacuolas, posiblemente se replica, transcita a través de la HBMEC, se libera en el lado basolateral y, por tanto, penetra en la barrera hematoencefálica.
Se ha informado de la invasión de células eucariotas por parte de C. freundii (22, 35). Sin embargo, éste es el primer informe sobre la invasión de HBMEC por C. freundii. Curiosamente, los requisitos eucariotas para la invasión de C. freundii son tan diversos como los tipos de células que C. freundii ha demostrado invadir. Por ejemplo, se ha demostrado que el inhibidor de fosas recubiertas de clatrina MDC inhibe la invasión de C. freundii en todos los demás tipos celulares ensayados (por ejemplo, las células epiteliales vasculares, intestinales y de la vejiga humanas), excepto, como se muestra en este estudio, en las HBMEC. Además, otras bacterias causantes de meningitis caracterizadas hasta ahora entran en HBMEC por una ruta(s) que depende de los microtúbulos y es sensible a la MDC (20, 24, 27). Se ha demostrado que los inhibidores de fosas recubiertas de clatrina MDC y ouabain no inhiben todos los receptores; por lo tanto, puede ser que el receptor necesario para la invasión de C. freundii en HBMEC no se vea afectado por el inhibidor MDC o ouabain. Aunque las pruebas recogidas hasta ahora sugieren que la entrada de C. freundii en HBMEC puede no producirse a través de una ruta mediada por un receptor sensible a la MDC o a la ouabaína, parece que se requiere tanto la acidificación del endosoma como la síntesis de proteínas de novo. Los datos disponibles sugieren dos posibles escenarios. La acidificación del endosoma puede ser necesaria como desencadenante ambiental para la supervivencia bacteriana intracelular. Se han caracterizado requisitos similares para la invasión epitelial de Salmonella (26). Alternativamente, la acidificación del endosoma y la síntesis de proteínas pueden ser necesarias para la separación del complejo ligando-receptor, la síntesis del receptor y/o la presentación del receptor a la superficie de las HBMEC para que se produzca la invasión de C. freundii. Este último escenario recuerda a otros patógenos invasivos, en los que el contacto del organismo viable es necesario para la modulación de las moléculas de adhesión celular eucariotas que son necesarias para la invasión (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y el receptor del factor activador de plaquetas) (2). Se están realizando experimentos en nuestro laboratorio para distinguir entre estos escenarios propuestos.
Los ensayos de invasión realizados en presencia de inhibidores de microtúbulos (tanto agentes despolimerizadores como estabilizadores) disminuyeron significativamente la capacidad de las HBMEC para absorber C. freundii. Los experimentos de microscopía confocal con anticuerpos anti-α-tubulina mostraron que los microtúbulos se agregan después de que las HBMEC entren en contacto con C. freundii. La agregación de microtúbulos fue un proceso dependiente del tiempo; no se observó ninguna agregación a los 5 minutos, se vio poca en 15 minutos y se observó una clara agregación después de 30 minutos de incubación deC. freundii con HBMEC. Esta agregación de microtúbulos se inhibió cuando las células fueron tratadas con inhibidores de microtúbulos o con agentes inhibidores de microfilamentos. Es interesante observar que el patrón de tinción de agregación de microtúbulos no se colocalizó con la unión bacteriana y que las zonas de HBMEC que no mostraban la unión de C. freundii también mostraban una aglomeración pronunciada de microtúbulos. Esto sugiere que el contacto de la bacteria con la HBMEC puede estimular globalmente la agregación de microtúbulos. Queda por ver si la agregación de microtúbulos es resultado de un factor bacteriano secretado o de una respuesta paracrina a la unión de las bacterias con las HBMEC. Además, la agregación de microtúbulos en respuesta a la unión de C. freundii puede estar relacionada con la postulada presentación del receptor mediante la síntesis de proteínas de novo y la acidificación del endosoma. Se ha demostrado previamente que el transporte de muchos receptores hacia y desde la superficie celular depende de los microtúbulos (10). Por lo tanto, una explicación del efecto inhibidor de los microtúbulos sobre la entrada de C. freundii en HBMEC es que los agentes pueden disminuir el número de receptores de HBMEC que median la invasión de C. freundii. Se están realizando experimentos para discernir entre estas posibilidades.
Se ha demostrado anteriormente que los microtúbulos son necesarios para la invasión de muchos patógenos (por ejemplo, Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, E. coli enteropatógena y enterohemorrágica, y Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). El pensamiento general ha sido que, aunque estos patógenos pueden entrar por vías dependientes de los microtúbulos, normalmente no se replican intracelularmente (6). Los datos adquiridos en este estudio a partir de ensayos de invasión extendida y análisis de TEM sugieren que C. freundii puede ser una excepción a esa generalización. A diferencia de lo que se ha descrito para otra bacteria que se replica en la intravacuola, Legionella pneumophila(12), no se observó la aparición de mitocondrias o ribosomas en las proximidades de la bacteria. Esto sugiere que C. freundii puede no utilizar estos orgánulos para obtener energía directamente o que el reclutamiento de proteínas específicas de la célula huésped puede no ser necesario para la supervivencia y proliferación intracelular (como en el caso de L. pneumophila). De especial relevancia para las infecciones del sistema nervioso central, se ha demostrado que otras bacterias causantes de meningitis, como E. coli K1, GBS y S. pneumoniae, invaden (1, 13, 25) o invaden y transcitan (20, 27) BMEC; sin embargo, no se ha encontrado que estos organismos se repliquen dentro de HBMEC. Como se ha descrito anteriormente, la meningitis por Citrobacter se ha documentado por su alta frecuencia de formación de abscesos cerebrales. Queda por determinar si la replicación dentro de las vacuolas de HBMEC es exclusiva de Citrobacter y si existe una correlación con la formación de abscesos.
La citocalasina D inhibe la invasión de C. freundii en HBMEC; sin embargo, utilizando la inmunotinción, no encontramos una reorganización detectable de los microfilamentos cuando C. freundii interactuó con HBMEC (datos no mostrados). Además, el pretratamiento con citocalsina D de las HBMEC inhibió la agregación de microtúbulos dependiente de la bacteria, tal y como se visualizó mediante microscopía confocal. Estos resultados pueden tener varias explicaciones. El efecto de la citocalsina D sobre la agregación de microtúbulos dependiente de la bacteria puede deberse a los efectos indirectos del inhibidor de microfilamentos sobre la red de microtúbulos. Por ejemplo, se ha observado que los microtúbulos actúan como estructuras de anclaje para la F-actina (28). Por lo tanto, la alteración de la red de microfilamentos puede afectar a la red de microtúbulos y, por lo tanto, afectar indirectamente a la invasión de C. freundii dependiente de los microtúbulos en HBMEC. Alternativamente, un paso de invasión dependiente de actina puede preceder a un paso dependiente de microtúbulos en la invasión de C. freundii a HBMEC. Este paso inicial puede dar lugar a la reorganización de los microfilamentos cuando las bacterias están inicialmente en contacto con la HBMEC; sin embargo, estos eventos pueden ser transitorios, y el diseño experimental que utiliza la microscopía de inmunofluorescencia puede no detectar adecuadamente su ocurrencia. Una situación similar se observa en el caso de la invasión mediada por Yersiniainvasin (36). Por lo tanto, si las etapas iniciales de la invasión se impiden con la citocalasina D, las etapas posteriores de la invasión que dependen de los microtúbulos no se desencadenan. Se ha demostrado previamente que la actina funciona en la translocación de los factores proteicos de unión a actina a la membrana plasmática, así como en la señalización citosólica (19). Además, la citocalasina D inhibe la entrada de Salmonella a través de la interrupción de la translocación de las proteínas de unión a actina al sitio de entrada de la bacteria (7). Es posible que en el caso de la invasión de C. freundii en HBMEC, los microfilamentos de actina sean necesarios para la señalización citosólica y/o la penetración bacteriana en la membrana plasmática, y que los microtúbulos sean necesarios para el transporte de las bacterias unidas a la membrana desde la membrana plasmática hacia el lado basolateral (o simplemente más adentro de la célula). En resumen, los resultados presentados aquí indican que C. freundii puede invadir, multiplicarse y transcitar HBMEC in vitro. La determinación de la base genética de estos fenotipos proporcionará una visión significativa de la fisiopatología de la Citrobactermeningitis y ayudará potencialmente a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y preventivas. Además, un amplio análisis molecular comparativo de Citrobacter con otras bacterias causantes de meningitis puede arrojar luz sobre la propiedad única de Citrobacter de formar abscesos cerebrales.