Abstracto
La existencia de células madre en el líquido amniótico humano se comunicó por primera vez hace casi diez años. Desde este descubrimiento, los conocimientos sobre estas células han aumentado drásticamente. Hoy en día, las células madre de líquido amniótico (AFS) son ampliamente aceptadas como una nueva y poderosa herramienta para la investigación básica, así como para el establecimiento de nuevos conceptos terapéuticos basados en células madre. Es posible generar líneas celulares monoclonales de AFS genómicamente estables que albergan un alto potencial proliferativo sin plantear problemas éticos. Muchos grupos diferentes han demostrado que las células AFS pueden diferenciarse en los tres linajes de la capa germinal, lo que es relevante tanto para el uso científico como terapéutico de estas células. De especial importancia para este último es el hecho de que las células AFS son menos tumorigénicas que otros tipos de células madre pluripotentes. En este artículo, hemos resumido los conocimientos actuales sobre este campo científico relativamente joven. Además, discutimos las perspectivas futuras relevantes de esta prometedora área de investigación con células madre, centrándonos en las próximas preguntas importantes, que necesitan ser respondidas.
1. Introducción
Aunque las células del líquido amniótico humano se utilizan ampliamente en el diagnóstico prenatal de rutina, el conocimiento sobre estas células sigue siendo limitado. Sin embargo, la noción de que en el líquido amniótico están presentes células indiferenciadas y diferenciadas de diversos orígenes y linajes ha sido apoyada por varios informes en las últimas tres décadas. Esto no es sorprendente, teniendo en cuenta que se han detectado en el líquido amniótico células pertenecientes al epitelio amniótico, a la piel fetal y a los sistemas urogenital, respiratorio y gastrointestinal del feto. Durante una gestación prolongada, pueden encontrarse en el líquido amniótico secreciones respiratorias, urinarias e intestinales del feto. Además, también se sabe que la composición, la morfología y las propiedades de crecimiento de las muestras de células del líquido amniótico se ven afectadas por ciertas patologías fetales, como por ejemplo, los defectos del tubo neural o la gastrosquisis.
El nuevo interés por las células derivadas del líquido amniótico se inició con dos hallazgos independientes. En 2001, se sugirió que las células de líquido amniótico podrían utilizarse en enfoques de ingeniería de tejidos para la reparación quirúrgica de anomalías congénitas en el periodo perinatal. Los autores aislaron mecánicamente una subpoblación de células del líquido amniótico de ovejas preñadas con una morfología distinta. El perfil inmunocitoquímico de estas células era muy comparable al de las células de linaje mesenquimal, fibroblasto/miofibroblasto. Estas células derivadas del líquido amniótico, que muestran una proliferación mucho más rápida que las células fetales y adultas comparables, pudieron cultivarse en andamios de polímero de ácido poliglicólico hasta alcanzar capas celulares confluentes. En un principio se habló de que un constructo de este tipo sería óptimo para funcionar como injerto para su implantación en el periodo neonatal o incluso antes del nacimiento. Esto podría ser de especial interés para los niños nacidos con un defecto en la pared corporal, que son demasiado jóvenes para que se pueda tomar un injerto de otra parte de su cuerpo para la cirugía reconstructiva . Los resultados obtenidos en modelos animales son realmente alentadores. Sin embargo, hasta donde sabemos, no conocemos ningún informe que describa el uso clínico de este enfoque terapéutico basado en células en humanos hasta ahora.
Otro hallazgo sobre las células del líquido amniótico inició un campo de investigación muy prometedor y de rápido crecimiento. Hace casi diez años, se publicó la primera sugerencia de que el líquido amniótico humano era una nueva fuente putativa de células madre. La primera prueba de la existencia de células AFS se demostró con el descubrimiento de un tipo de célula altamente proliferativa en el líquido amniótico humano que expresaba el marcador de células madre pluripotentes Oct4. Además de que estas células expresan marcadores conocidos como específicos de las células madre pluripotentes, se demostró que expresaban proteínas del ciclo celular conocidas como específicas de las células ciclantes . Después de esta primera descripción, muchos grupos han confirmado la existencia de estas células AFS Oct4+/c-Kit+ y han informado de su potencial para diferenciarse en linajes hematopoyéticos, neurogénicos, osteogénicos, condrogénicos, adipogénicos, renales, hepáticos y otros. Aunque, en lo que respecta a sus propiedades biológicas y a su patrón de expresión de marcadores, las células AFS parecen ser más similares a las células madre embrionarias (ES) que, por ejemplo, a las células trofoblásticas, el origen preciso de las células AFS sigue siendo esquivo. Las investigaciones bioquímicas, inmunocitoquímicas, biológicas y morfológicas han revelado que las células AFS representan una entidad nueva y específica, distinta de las células madre embrionarias o de otros tipos de células madre, como las que pueden aislarse de fuentes epiteliales amnióticas o trofoblásticas. Hoy en día es de gran interés aclarar dos cuestiones relevantes en relación con las células AFS. ¿De dónde proceden? ¿Tienen una función biológica in vivo? Ya hemos comentado anteriormente que las células AFS probablemente podrían desempeñar un papel en los procesos de curación de heridas intrauterinas. Sin embargo, hasta ahora no existe ningún apoyo experimental para esta hipótesis. Es obvio que los escenarios experimentales que permiten probar esta hipótesis no son realmente fáciles de imaginar o prácticos en este momento (o aún no se han desarrollado).
Desde su primer descubrimiento, era de suma importancia aclarar la cuestión de si las células AFS realmente albergan un potencial de diferenciación pluripotente a través de iniciar con éxito la diferenciación en diferentes linajes a partir de una sola célula madre. Es importante señalar que muchos informes diferentes en la literatura que afirman describir la investigación sobre las células AFS ni siquiera aclaran con qué tipo de células están trabajando. Muy a menudo, los investigadores se limitaron a utilizar una mezcla de células procedentes del líquido amniótico obtenidas mediante procedimientos de cultivo específicos. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, estas mezclas de células derivadas del líquido amniótico contienen una gran variedad de tipos celulares específicos, tanto indiferenciados como diferenciados. Siempre que un estudio informa de un potencial de diferenciación sobre linajes celulares específicos, es de suma importancia aclarar primero qué tipo de célula de partida se utilizó (mediante una caracterización biológica e inmunocitoquímica detallada). Además, la prueba de que las células AFS realmente albergan un potencial de diferenciación pluripotente sólo puede obtenerse a partir de una única célula caracterizada como célula madre. En cualquier otro caso, se podría suponer que una mezcla de células de líquido amniótico, que se ha utilizado como material de partida, contenía muy probablemente un tipo celular con el potencial de diferenciarse en un linaje específico y otros tipos celulares con otros potenciales de diferenciación. O bien el protocolo de diferenciación in vitro utilizado en algunos estudios indujo una selección (mediante una ventaja de crecimiento) para un tipo celular ya (incluido) diferenciado en lugar de la diferenciación de buena fe. Los enfoques de una sola célula son obligatorios y prácticos después de los experimentos de dilución mínima.
El primer grupo de investigación, que realmente tenía en cuenta esto, informó que descendiendo de una sola célula AFS positiva a Oct4, era posible inducir la diferenciación adipogénica, osteogénica y neurogénica . Los autores utilizaron un protocolo de cultivo en dos etapas, seguido de una detallada caracterización inmunocitoquímica del tipo de célula madre obtenido . Tres años después, otro grupo de investigación aisló células AFS monoclonales mediante selección por citometría de flujo y dilución mínima, que expresaban los marcadores de células madre c-Kit y Oct4 . Los autores describieron el primer establecimiento de líneas celulares AFS monoclonales, que albergaban un alto potencial proliferativo y que podían cultivarse durante muchos periodos de ciclado con un estado cromosómico estable. El uso de estas líneas celulares de AFS les permitió demostrar que se podía inducir la diferenciación de células adipogénicas, osteogénicas, miogénicas, endoteliales, neurogénicas y hepáticas. Es importante destacar que estos autores también informaron de que las células AFS, a diferencia de las células ES, no inducen la formación de tumores en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (para una discusión detallada de este aspecto, véase más adelante).
Las células ES, cuando se cultivan en ausencia de factores de diferenciación, pueden formar espontáneamente agregados multicelulares tridimensionales denominados cuerpos embrioides. En el pasado, los cuerpos embrionarios se han considerado ampliamente como un punto de partida óptimo para la diferenciación de las células madre en varios linajes. En consecuencia, la formación de cuerpos embrionarios seguida de diferentes enfoques que inducen la diferenciación se considera una forma adecuada de demostrar el potencial de diferenciación pluripotente de un tipo específico de células madre. En consecuencia, era interesante comprobar si, partiendo de una sola célula, las células AFS son capaces de formar cuerpos embrionarios. Efectivamente, las células AFS humanas monoclonales pueden formar cuerpos embrionarios cuando se cultivan sin factores de antidiferenciación en condiciones en las que no pueden adherirse a la superficie de las placas de cultivo y sin contacto con células alimentadoras. La formación de estos agregados multicelulares tridimensionales va acompañada de una disminución de la expresión de los marcadores de las células madre y de la inducción de la diferenciación en diferentes linajes. Este estudio que demostró el potencial de formar cuerpos embrionarios fue la prueba definitiva de que las células AFS son pluripotentes. Además, ahora permite recapitular e investigar las estructuras tridimensionales y los contextos a nivel de tejido de muchos fenómenos de diferenciación durante la embriogénesis temprana de los mamíferos . Estos hallazgos sobre la pluripotencia de las células AFS se obtuvieron utilizando líneas celulares monoclonales generadas a través de enfoques de clasificación celular magnética y dilución mínima a partir de muestras de amniocentesis humanas. Hoy en día, existen muchas líneas monoclonales diferentes establecidas, que pueden expandirse como células madre inmaduras con una alta tasa de proliferación en cultivo sin necesidad de células alimentadoras.
En conjunto, el estado actual del conocimiento es que las células AFS albergan el potencial de diferenciarse en tipos celulares de las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) y pueden formar cuerpos embrionarios, conocidos como el paso principal en la diferenciación de las células madre pluripotentes. En comparación con otros tipos de células madre, como las células madre adultas, las células ES o las células madre pluripotentes inducidas (iPS), las células AFS presentan ventajas específicas. Las células madre adultas suelen ser difíciles de muestrear, presentan un menor potencial de diferenciación que las células AFS y no pueden cultivarse con una elevada actividad proliferativa. La generación de líneas de células ES mediante la destrucción de un embrión humano plantea una serie de cuestiones éticas, que se discuten de forma diferente en cada país. Además, las células ES son tumorigénicas, mientras que las células AFS, como ya se ha mencionado anteriormente, no inducen la formación de tumores en ratones con inmunodeficiencia combinada grave. En comparación con las células iPS, no es necesaria la inducción ectópica de la pluripotencia en las células AFS. Las células AFS son genómicamente estables y no albergan la memoria epigenética ni las mutaciones somáticas de las células fuente ya diferenciadas. Además, se ha informado de que las células iPS acumulan anomalías cariotípicas y mutaciones genéticas durante su propagación en cultivo. Recientemente, se ha informado de que durante la inducción ectópica de la pluripotencia las células iPS sólo recapitulan de forma incompleta su patrón epigenético. Este importante hallazgo debe ser tenido en cuenta cuando se planea utilizar estas células para investigaciones detalladas sobre los procesos de diferenciación, así como cuando se consideran para nuevos enfoques terapéuticos putativos. Las células AFS ya presentan propiedades de células madre y no necesitan la inducción ectópica de la pluripotencia. Además, las células AFS ya presentan el patrón epigenético de las células madre. En resumen, no es de extrañar que muchos intentos se centren actualmente en la cuestión de en qué condiciones podrían utilizarse las células AFS para las terapias basadas en células madre. Además, las células AFS se están aceptando cada vez más como una herramienta óptima para la investigación básica.
Aunque se considera que las células ES, las células iPS y las células AFS albergan un potencial de diferenciación pluripotente, la cuestión de si presentan el mismo espectro cualitativo de potencial de diferenciación sigue sin respuesta. Las células madre pluripotentes se definen como células autorreplicantes (las células pueden dividirse por sí mismas) que se sabe que tienen la capacidad de desarrollarse en células y tejidos de las capas germinales primarias, ectodermo, mesodermo y endodermo. Se ha demostrado que estos tres tipos de células madre (ES, iPS y AFS) albergan el potencial de diferenciarse en células de las tres capas germinales. Las tres también pueden formar cuerpos embrionarios. Sin embargo, hay que comprobar en cada caso si realmente tienen un potencial comparable para diferenciarse en un tipo celular específico con todas sus funciones biológicas conocidas. De hecho, creemos que es necesario examinar y comparar directamente sus potenciales de diferenciación y seleccionar los tipos celulares más adecuados para proyectos de ciencia básica y para el uso putativo en nuevas terapias basadas en células madre. Además, una diferencia obvia entre estos tres tipos de células madre pluripotentes debería ser investigada con más detalle en el futuro. Desde la primera descripción de su cultivo in vitro, se sabe que las células ES son tumorigénicas. Del mismo modo, las células iPS inducen la formación de tumores cuando se trasplantan por vía subcutánea a ratones desnudos. Sin embargo, se ha informado de que las células AFS no forman tumores en ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Dado que esto último sólo se ha estudiado hasta ahora en un proyecto en el que se analizaba un conjunto específico de trasplantes en animales, están justificadas nuevas investigaciones para aclarar si las células AFS son realmente no tumorigénicas. Obviamente, si es cierto, esto supondría una importante ventaja sobre las células ES e iPS, al menos con respecto a un posible uso clínico.
2. Células AFS para la terapia: Perspectivas futuras
Mucha de la emoción que rodea a las células madre humanas está relacionada con la esperanza de los médicos y los pacientes de que estas células puedan ser utilizadas alguna vez para terapias celulares para un amplio espectro de enfermedades humanas. Aquí hay que decir claramente que el trabajo sobre las terapias basadas en células AFS está todavía en su infancia. Actualmente se están investigando muchas cuestiones, y hasta ahora ningún enfoque terapéutico basado en células AFS ha alcanzado el nivel de aplicación clínica de rutina. Sin embargo, diversos resultados de nuevas investigaciones aportan pruebas sólidas de que las células AFS podrían servir de hecho como una poderosa herramienta en la medicina regenerativa.
Por ejemplo, las insuficiencias renales agudas y crónicas son trastornos con altas tasas de morbilidad y mortalidad. El trasplante de riñón sigue siendo la opción de tratamiento más eficaz para la mayoría de los pacientes con enfermedad renal terminal. Por desgracia, la escasez de órganos compatibles es un factor muy limitante. Las estrategias de tratamiento también se basan en la diálisis renal convencional, pero la tasa de mortalidad de los pacientes que requieren diálisis crónica es elevada. En consecuencia, el uso putativo de las células madre en la reparación de la lesión renal pasó a primer plano. Varios estudios publicados recientemente sobre la diferenciación renal de las células AFS hacen que resulte tentador especular con la posibilidad de que estas células madre puedan ser consideradas como una nueva fuente prometedora de terapias celulares para la reparación de lesiones renales y justifiquen nuevas investigaciones en este sentido. Utilizando un ensayo de reagregación renal, hemos publicado recientemente que las células AFS albergan el potencial de diferenciarse en linajes nefrogénicos y que esta capacidad depende de la vía de señalización de la diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) (véase también la discusión más abajo). Otros han demostrado que las células AFS humanas pueden integrarse en los tejidos renales cuando se inyectan en riñones embrionarios murinos aislados o que la inyección de células AFS en riñones dañados de ratones con necrosis tubular aguda relacionada con la rabdomiólisis puede mediar un efecto protector . Aunque estos y otros datos hacen que sea tentador especular que las células AFS pueden proporcionar enfoques alternativos exitosos para el tratamiento de, por ejemplo, la necrosis tubular aguda, muchas más preguntas deben ser respondidas antes de que tales terapias basadas en células puedan ser consideradas para aplicaciones de rutina en los seres humanos.
Por muchas razones diferentes, el establecimiento de nuevas terapias basadas en células madre para patologías del sistema nervioso central hasta ahora incurables, como la enfermedad de Parkinson, la lesión de la médula espinal, la esclerosis múltiple o el accidente cerebrovascular, es también de gran interés. Las células madre neurales, que se han investigado con este fin, pueden encontrarse en el sistema nervioso central adulto y en el embrión en desarrollo, pero estos tejidos no son fáciles de conseguir y plantean problemas éticos. En los últimos años, diferentes grupos han informado sobre el potencial de diferenciación neurogénica de las células AFS. Sin embargo, antes de que se puedan considerar los siguientes pasos en la dirección del uso clínico de los enfoques basados en células AFS, se debe proporcionar la prueba de que las AFS realmente pueden formar neuronas maduras. De hecho, todavía hay un debate en curso en la literatura, discutiendo si las células AFS son realmente capaces de formar neuronas funcionales. En un futuro próximo, será muy importante averiguar qué tipo de células neurogénicas pueden desarrollarse a partir de las células AFS. La cuestión de si las células AFS pueden diferenciarse en neuronas maduras funcionales debe investigarse analizando la capacidad de disparar potenciales de acción sensibles a la tetrodotoxina con la forma y duración características o demostrando la comunicación sináptica mediante microscopía electrónica.
Aquí sería posible discutir algunos ejemplos más para enfoques terapéuticos putativos utilizando células AFS. A veces se argumenta que deben investigarse muchas cuestiones básicas relativas al origen, la tumorigenicidad, el potencial de diferenciación, el estado epigenético o la estabilidad genómica antes de que las células AFS puedan seguir considerándose una herramienta terapéutica. Sin embargo, creemos que todos estos aspectos deberían estudiarse en paralelo. Además, para futuras consideraciones es realmente importante comparar cuantitativa y cualitativamente todas estas propiedades de las células AFS con las de otros tipos de células madre pluripotentes o adultas.
3. Las células AFS en la ciencia básica: Perspectivas futuras
Las células madre son herramientas muy útiles para estudiar la regulación molecular y celular de los procesos de diferenciación. Un enfoque para aprender más sobre el papel de, por ejemplo, un gen específico para un determinado proceso de diferenciación es derribar la expresión endógena del gen de interés. Este enfoque permite aclarar el papel de la expresión génica modulada para el potencial celular de diferenciación en un linaje específico. Recientemente hemos publicado un protocolo para el silenciamiento prolongado de genes mediado por siRNA en células AFS. Este protocolo, que ya hemos probado para una variedad de genes diferentes, permite una regulación a la baja del 96-98% de la expresión génica endógena durante un período de tiempo de unos 14 días en las células AFS y en una variedad de otras células primarias, inmortalizadas o transformadas.
Más recientemente, hemos hecho uso de este enfoque para estudiar el papel de la vía mTOR en las células AFS humanas. La desregulación de los reguladores de mTOR, como, por ejemplo, Wnt, Ras, TNF-α, PI3K o Akt, es una característica distintiva de muchos cánceres humanos. Las mutaciones en los genes componentes de la vía mTOR TSC1, TSC2, LKB1, PTEN, VHL, NF1 y PKD1 desencadenan el desarrollo de los síndromes genéticos humanos la esclerosis tuberosa, el síndrome de Peutz-Jeghers, el síndrome de Cowden, el síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba, la enfermedad de Lhermitte-Duclos, el síndrome de Proteus, la enfermedad de von Hippel-Lindau, la neurofibromatosis tipo 1 y la poliquistosis renal. Además de una variedad de trastornos de un solo gen y de la tumorigénesis, también se ha demostrado que la vía mTOR es relevante para el desarrollo de enfermedades complejas, como la hipertrofia cardíaca, la obesidad o la diabetes de tipo 2. Todas estas consecuencias patológicas de la desregulación de la actividad de mTOR son explicables, teniendo en cuenta que mTOR es el componente clave de la cascada de señalización de la insulina, que participa en una amplia variedad de procesos diferentes, como el crecimiento celular, la proliferación, el metabolismo, la transcripción, la traducción, la supervivencia, la autofagia, el envejecimiento, la diferenciación y la oncogénesis . Hemos descubierto que todo el proceso de formación de cuerpos embrionarios de las células AFS depende de las dos enzimas que contienen mTOR, mTORC1 y mTORC2 . Como se ha mencionado anteriormente, la modulación de los componentes de mTOR mediante enfoques específicos de siRNA reveló que el potencial de las células AFS para contribuir a la formación de tejido renal está regulado por esta vía de señalización . Más recientemente, el enfoque de derribar las funciones de los genes endógenos en las células AFS nos permitió detectar que los dos reguladores de mTOR, tuberina y PRAS40, son guardianes antiapoptóticos durante la diferenciación temprana de las células AFS humanas . En conjunto, creemos firmemente que el enfoque de la supresión de la expresión génica endógena mediada por siRNA en líneas celulares monoclonales de AFS humanas es una herramienta muy poderosa para futuros proyectos relacionados con la regulación molecular de la diferenciación.
Otro aspecto muy interesante para la futura investigación básica es el banco de líneas celulares de AFS portadoras de mutaciones naturales, que son relevantes para ciertos fenotipos patológicos humanos. En genética médica, el desarrollo futuro de nuevas estrategias profilácticas y terapéuticas depende directamente de una mejor comprensión de los mecanismos por los que la variación genética natural contribuye a la enfermedad. En los países en los que es legal el uso de embriones humanos para la investigación, se generan líneas de células madre embrionarias portadoras de determinados defectos hereditarios a partir de embriones con todo tipo de anomalías cromosómicas numéricas o mutaciones específicas de enfermedades monogénicas excluidas de la transferencia al útero tras el diagnóstico genético preimplantacional . También se han generado ya diversas líneas iPS de trastornos de un solo gen, síndromes cromosómicos y enfermedades complejas, con el objetivo de utilizarlas para proyectos de investigación básica . Sin embargo, como ya se ha comentado en detalle, tanto las células ES como las iPS presentan desventajas importantes en comparación con las células AFS. Además de otros enfoques invasivos, la amniocentesis es un procedimiento estándar ampliamente aceptado en los cuidados prenatales desde la década de 1970. Es casi imprevisible el número de amniocentesis que se realizan al año en todo el mundo. En conjunto, creemos que la generación y el almacenamiento de líneas celulares humanas normales de AFS y de líneas celulares de AFS con aberraciones cromosómicas, así como de líneas celulares de AFS con mutaciones específicas de enfermedades monogénicas, podrían proporcionar herramientas muy poderosas para la modelización de enfermedades en futuras investigaciones. Aquí es importante señalar que el almacenamiento de células AFS con fines no relacionados con la investigación, con el objetivo de proteger la salud de un niño disponiendo de células madre durante toda su vida, es otra cosa. Algunas empresas de Europa y Estados Unidos ya se ofrecen a almacenar células AFS cuando, por ejemplo, se realiza una amniocentesis para el diagnóstico prenatal. Sus argumentos para la conservación de las células AFS son que estas células podrían ayudar una vez al tratamiento de lesiones (por ejemplo, la reparación del cartílago de la rodilla), la curación de heridas o el desarrollo de la piel para injertos específicos. Como se ha mencionado anteriormente, en el futuro se requerirá una amplia investigación para establecer el posible uso clínico de las células madre de AFS en humanos. Los prometedores resultados obtenidos durante los últimos años en este todavía joven campo científico justifican claramente nuevas investigaciones detalladas en la dirección de la putativa aplicación clínica de las células AFS. En este artículo nos gustaría enfatizar que el almacenamiento de células AFS con mutaciones naturales para la investigación genética humana debería haber comenzado tan pronto como sea posible en diferentes laboratorios bajo estándares comparables de alta calidad. Valdría la pena animar a los diferentes laboratorios a tomar muestras de líquido amniótico de amniocentesis con indicaciones comparables de semanas de embarazo similares. Deberían estandarizarse los protocolos para aislar las células madre, realizar diluciones mínimas y caracterizar las líneas celulares monoclonales de AFS así obtenidas. El biobanco de líneas celulares AFS con mutaciones caracterizadas permitiría saltar al siguiente paso de la investigación genética humana utilizando células madre humanas .