Zpět k základům – Co je to imunoanalýza – verze PDF ke stažení
Co je to imunoanalýza nebo ELISA?
Imunoanalýzy jsou rychlé a přesné testy, které lze použít na místě i v laboratoři k detekci specifických molekul. Imunoanalýzy se spoléhají na přirozenou schopnost protilátky vázat se na specifickou strukturu molekuly. Protilátky jsou bílkoviny vytvářené živočichy v reakci na vniknutí cizí molekuly (antigenu) do těla. Protilátky se nacházejí v krvi a tkáňových tekutinách a vážou se na antigen, kdykoli se s ním setkají. Protože jsou protilátky vyvinuty na specifickou trojrozměrnou strukturu antigenu nebo analytu, jsou vysoce specifické a vážou se pouze na tuto strukturu. Po přečištění z krve jsou monoklonální a polyklonální protilátky ideálními analytickými činidly pro detekci a sledování specifických cílových molekul s omezenými interferencemi jiných látek. Čtyři typické formáty ELISA jsou: sendvičová imunoanalýza protilátek, imunoanalýza antigen-down, kompetitivní inhibiční analýza a rychlá analýza.
Sendvičová imunoanalýza protilátek
V typické sendvičové imunoanalýze protilátek se monoklonální protilátka adsorbuje na plastovou mikrotitrační destičku. Když se na destičku přidá testovaný vzorek, protilátka na destičce naváže cílový antigen ze vzorku a zadrží jej na destičce. Když se v dalším kroku přidá polyklonální protilátka, naváže se také na cílový antigen (již navázaný na monoklonální protilátku na destičce), čímž se vytvoří „sendvič“ antigenu mezi dvěma různými protilátkami.
– Krok 1: Monoklonální protilátky se adsorbují na jamku plastové mikrotitrační destičky s potahovacím pufrem (bez přidání vzorku).
– Krok 2: Přidání vzorku (např. lidské krve, vhodně naředěné) do jamky mikrotitrační destičky. Cílový antigen se naváže na protilátku adsorbovanou na destičce, čímž se antigen udrží v jamce.
– Krok 3: Navázání polyklonální protilátky konjugované s enzymem na cílový antigen (navázaný na monoklonální protilátku na destičce), čímž se vytvoří „sendvič“ antigenu mezi dvěma různými protilátkami.
– Krok 4: Přidání kolorimetrického substrátu pro detekci enzymem konjugovaných polyklonálních protilátek vytvoří barevný signál úměrný množství cílového antigenu přítomného v původním vzorku přidaném na destičku.
Antigen-down (imunitní test) imunoanalýza
V antigen-down (imunitní test) imunoanalýze je analyt potažen vrstvou použitou k navázání protilátek nacházejících se ve vzorku. Po přidání vzorku (např. lidského séra) se antigen na destičce naváže na protilátky (např. IgE) ze vzorku, které se pak zadrží v jamce. Dále se přidá druhově specifická protilátka (například proti lidskému IgE) značená HRP, která se naváže na protilátku vázanou na antigen na destičce. Čím vyšší je signál, tím více protilátek je ve vzorku. Testy antigen-down (test imunity) mohou být konfigurovány jako rychlé testy a často se používají k diagnostice alergických stavů – běžně se krev pacienta testuje proti různým alergenům, aby se zjistilo, zda má osoba protilátky proti danému alergenu.
Kompetitivní inhibiční imunoanalýza
Kromě sendvičového formátu monoklonální-polyklonální (Mo-Po) protilátky je mnoho imunoanalýz strukturováno ve formátu kompetitivní inhibice. Konkurenční inhibiční testy se často používají k měření malých analytů, protože kompetitivní inhibiční testy vyžadují vazbu pouze jedné protilátky, nikoli dvou, jako je tomu u standardních formátů ELISA. Vzhledem k vysoké pravděpodobnosti výskytu sterických překážek, když se dvě protilátky snaží navázat na malou molekulu současně, nemusí být sendvičový formát testu proveditelný. Proto by byla vhodnější kompetitivní inhibiční zkouška.
Při sekvenční kompetitivní inhibiční zkoušce se vzorek a konjugovaný analyt přidávají postupně jako při sendvičové zkoušce, zatímco při klasické kompetitivní inhibiční zkoušce se tato činidla inkubují současně. Při sekvenční kompetitivní inhibiční zkoušce je monoklonální protilátka nanesena na 96jamkovou mikrotitrační destičku. Po přidání vzorku zachytí MoAb volný analyt ze vzorku. V dalším kroku se přidá známé množství analytu značeného buď biotinem, nebo HRP. Značený analyt se pak také pokusí navázat na MoAb adsorbovaný na destičce, avšak značenému analytu brání ve vazbě na MoAb přítomnost dříve navázaného analytu ze vzorku. To znamená, že značený analyt nebude navázán monoklonálem na destičce, pokud monoklonál již navázal neznačený analyt ze vzorku. Množství neznačeného analytu ve vzorku je nepřímo úměrné signálu generovanému značeným analytem. Čím nižší je signál, tím více je ve vzorku neznačeného analytu. Standardní křivku lze sestrojit pomocí sériových ředění neznačeného analytu. Následné hodnoty vzorku lze pak odečíst ze standardní křivky, jak se to dělá u sendvičových formátů ELISA. Klasický formát kompetitivní inhibiční zkoušky vyžaduje současné přidání značeného (konjugovaného analytu) a neznačeného analytu (ze vzorku). Značený i neznačený analyt pak současně soutěží o vazebné místo na monoklonální záchytné protilátce na destičce. Stejně jako u formátu sekvenční kompetitivní inhibice je barevný signál nepřímo úměrný koncentraci neznačeného cílového analytu ve vzorku. Detekci značeného analytu lze provést pomocí peroxidázového substrátu, například TMB, který lze odečíst na čtečce mikrotitračních destiček.
Rychlý imunoanalýzový test
Kromě mikrotitračních destiček jsou imunoanalýzy konfigurovány také jako rychlé testy, například domácí těhotenský test. Stejně jako testy na mikrotitračních destičkách používají rychlé testy k reakci s antigeny protilátky a mohou být vyvinuty jako sendvičové formáty MoAb-PoAb, kompetitivní inhibiční formáty a formáty antigen-down. U rychlotestu jsou protilátky a antigenní činidla vázány na porézní membrány, které reagují s pozitivními vzorky a zároveň odvádějí přebytečné tekutiny do nereaktivní části membrány. Rychlé imunoanalýzy se běžně dodávají ve dvou konfiguracích: test s bočním průtokem, kdy se vzorek jednoduše umístí do jamky a výsledky se odečtou okamžitě, a průtokový systém, který vyžaduje umístění vzorku do jamky, promytí jamky a nakonec přidání konjugátu analytického koloidního zlata a výsledek se odečte po několika minutách. Na jednom proužku nebo kazetě se testuje jeden vzorek. Vzhledem k tomu, že rychlé testy jsou rychlejší než testy na mikrotitračních destičkách, vyžadují jen malé zpracování vzorku, jsou často levnější a generují odpovědi ano/ne bez použití přístroje, jsou často používány v terénu nelaboranty, kteří testují celé vzorky. Rychlé imunoanalýzy však nejsou tak citlivé a nelze je použít k přesné kvantifikaci analytu (Self-monitoring hladiny glukózy v krvi u diabetiků je považován za kvantitativní rychlé testování, avšak technologie imunoanalýzy se pro tyto testy nepoužívá). Všechny rychlé imunoanalytické testy lze převést na test na mikrotitračních destičkách, ale ne všechny testy na mikrotitračních destičkách lze převést na rychlý test
.