PMC

U savců se autotomie zřejmě vyvinula několikrát, ale taxonomicky je řídká. Doložená autotomie je obvykle omezena na ocas a dochází k ní ztrátou ocasní pochvy (falešná autotomie) nebo zlomením napříč obratlem (pravá autotomie)2,5 . Kromě autotomie ocasu byly příležitostně zmíněny i druhy savců se slabou nebo křehkou kůží, ačkoli není známo, zda jsou tato zvířata schopna autotomie kůže. Proto jsme se nejprve snažili prozkoumat neoficiální důkazy o tom, že dva druhy afrických ostnokožců (Acomys kempi a Acomys percivali) ochotně svlékají části kůže jako únikové chování před predátory.

Pro ověření hypotézy, že A. kempi a A. percivali jsou schopny kožní autotomie, jsme odchytávali jedince do živých pastí na skalních výchozech (kopjes) ve střední Keni. Kromě ochranných chlupů se druhy rodu Acomys vyznačují přítomností ostnitých chlupů na hřbetě (obr. 1a, b). Manipulace s oběma druhy v terénu potvrdila, že energický pohyb často vede k potrhání kůže. Trhání mělo za následek velké otevřené rány nebo ztrátu kůže v rozsahu od malých kousků až po plochy dosahující přibližně 60 % celkové hřbetní plochy (obr. 1c). Kromě ztráty integumentů se u obou druhů projevila autotomie ocasní pochvy, jak již bylo dříve uvedeno u jiných druhů rodu Acomys, a jedinci byli často odchyceni s chybějícími ocasy2. U jedinců v zajetí jsme pozorovali rychlé hojení těžkých poranění kůže a rychlý opětovný růst ostnitých chlupů, které zcela zakrývaly poraněné místo (obr. 1d, e). Jedinci odchycení v terénu vykazovali podobné hojení a v některých případech i vzorované vlasové folikuly v anagenní (tj. růstové) fázi, které podle všeho na poraněných místech regenerovaly (obr. 1f).

Pro vyhodnocení, jak je možné, že se kůže Acomys tak snadno trhá, jsme si položili otázku, zda mechanické vlastnosti kůže Acomys nemohou stát za její pozorovanou slabostí. Na základě experimentů zkoumajících autotomii kůže u gekonů3 lze rozlišit slabou kůži (tj. kůži mající rovnoměrné strukturální vlastnosti, která selhává nebo praská při relativně nízkém indukovaném zatížení) od křehké kůže (tj. kůže mající specifické morfologické charakteristiky, jako je lomová rovina, která umožňuje uvolnění vnějších vrstev). Pro posouzení slabosti kůže jsme porovnali mechanické vlastnosti kůže Acomys a Mus. Při mechanickém zatěžování vykazovala kůže Mus před porušením pružné vlastnosti, zatímco kůže Acomys byla křehká a začala se trhat krátce po zatížení (obr. 2a). Z hřbetní kůže jsme odvodili křivky napětí a deformace pro stanovení průměrné pevnosti v tahu (σm) a zjistili jsme, že kůže Mus je 20krát pevnější než kůže Acomys (2,3 MPa ±0,19 a 0,11 MPa ±0,03) (obr. 2a, b). A konečně při výpočtu střední houževnatosti (W) bylo k přetržení kůže Mus zapotřebí téměř 77krát více energie než u kůže Acomys (obr. 2b). Tyto výsledky ukazují, že Acomys má kůži, která se snadno trhá (nebo praská) v reakci na nízké aplikované napětí, a poskytují mechanický základ pro slabost jejich kůže.

Pro posouzení, zda strukturální vlastnosti kůže Acomys přispívají k její mechanické slabosti, jsme zkoumali buněčné vlastnosti kůže A. percivali a zjistili jsme, že je anatomicky srovnatelná s kůží Mus a dalších hlodavců, i když s mnohem většími chlupovými folikuly (obr. 2c, d). Nenašli jsme žádné známky lomné roviny, což je mechanismus autonomie kůže u gekonů a scinků3. Při zkoumání elastinových vláken, která zvyšují elasticitu kůže, jsme zjistili, že všechny tři druhy mají podobné rozložení a množství elastinu v dermis a pod panniculus carnosus (obr. S1a-f). Zkoumáním podílu adnex (např. folikulů a přidružených žláz) v dermis jsme testovali, zda větší chlupové folikuly v kůži Acomys snižují celkovou plochu dermy zabíranou pojivovou tkání, a zjistili jsme, že je větší u A. percivali (55,61 % ±4,28) ve srovnání s M. musculus (43,65 % ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (obr. 2e, f). Tato zjištění naznačují, že ačkoli základní tkáňová struktura kůže Acomys je podobná kůži Musculus, prostor zabíraný adnexy v dermis snižuje absolutní obsah pojivové tkáně, což potenciálně přispívá ke snížené elasticitě a nižší pevnosti v tahu při namáhání kůže6. Absence lomové roviny toto zjištění podtrhuje a podporuje vrozenou strukturální odlišnost, která je základem pozorované slabosti kůže Acomys.

Vzhledem k její vrozené strukturální slabosti a sklonu k trhání jsme hodnotili schopnost Acomys hojit kožní rány pomocí malých (4 mm) a velkých (1,5 cm) excizních ran v plné tloušťce (FTE). U ran obou velikostí byla tvorba strupu a hemostáza rychlá a u velkých ran přispěla ke zmenšení plochy rány o 64 % ±3,1 po 24 hodinách od poranění (obr. S2a). Při hojení bez jizev u suchozemských salamandrů7 a savčích plodů8 dochází k reepitelizaci lůžka rány během několika dnů, zatímco reepitelizace 4mm rány v kůži dospělého potkana trvá 5-7 dnů9. U Acomys jsme zjistili, že pět ze šesti 4mm ran se kompletně reepitelizovalo do 3. dne po poranění (D3), zatímco u Mus se rány tak rychle nereepitelizovaly (obr. 2g, h). Po reepitelizaci se savci s volnou kůží (např. hlodavci, králíci atd.) spoléhají při hojení ran především na kontrakci10. Podobně jsme pozorovali vysokou míru kontrakce, která po 17 dnech představovala 95 % uzavření rány (obr. S2a-c). Na rozdíl od jizvení, kde se kolagenová vlákna organizují do husté sítě rovnoběžné s epidermis, při hojení bez jizev zaujímají kolagenová vlákna podobný vzor jako neporaněná dermis10. Při zkoumání extracelulární matrix (ECM) v D10 jsme u Mus pozorovali jizvení, zatímco u Acomys byla kolagenní vlákna méně hustě uspořádaná a obsahovala poréznější strukturu (obr. 2i, j). Pomocí pikrosiriovy červeně jsme zjistili, že v lůžku rány v D10 u Mus převažoval kolagen typu I, zatímco u Acomys byl ve větším množství kolagen typu III (obr. 2k, l). Tento rozdíl byl ještě výraznější u ran o velikosti 1,5 cm (obr. S3a-b‘). Tato data společně ukazují, že rychlá reepitelizace a kontrakce okrajů rány výrazně snižuje velikost otevřených kožních trhlin u Acomys. Naše zjištění, že ECM rány (1) se ukládá pomalu, (2) má porézní uspořádání a (3) převažuje v ní kolagen typu III, naznačují, že toto složení upřednostňuje regeneraci před fibrózou při opravě kůže u Acomys.

Pro testování regenerační schopnosti prostředí rány jsme odebrali vzorky velkých hojících se ran na důkaz neogeneze vlasových folikulů a regenerace kůže. Ve spojení s poréznější ECM jsme v lůžku rány mezi D21 a D28 pozorovali folikulogenezi normálních pelagických chlupů a velkých ostnitých chlupů a mohli jsme rozlišit staré, velké folikuly při okrajích rány od nově regenerovaných folikulů v lůžku rány (obr. 3a-d a obr. S3c-e). Zdálo se, že nové folikuly regenerují v celé nezatažené části lůžka rány, nejen v centrální oblasti (obr. 3c a obr. S3e), a pozorovali jsme regenerující vlasové folikuly v různých fázích vývoje (obr. 3a-m a obr. S4a-c). Lokalizovaná a vysoce proliferativní populace epidermálních buněk řídí vývoj vlasových folikulů a podobný jev jsme pozorovali i během regenerace folikulů (obr. 3e a obr. S4a-c). Abychom zjistili, zda se embryonální signální sítě používané během vývoje vlasových folikulů nasazují i během regenerace vlasových folikulů, zkoumali jsme keratin-17 (Krt17); ten je během vývoje kůže difuzně exprimován v epidermis a postupně se omezuje na vyvíjející se vlasové folikuly11. Po reepitelizaci byl KRT17 vysoce obohacen v celé neoepidermis překrývající lůžko rány v D14 a jak se v lůžku rány tvořily nové vlasové folikuly, KRT17 se omezil na folikulární epitel (obr. 3f a obr. S5). Během opravy rány u Mus jsme zjistili, že KRT17 byl také vysoce regulován v reepitelizaci epidermis v D14 (obr. S5), a přestože KRT17 byl lokalizován na některých bazálních keratinocytech v epidermis Mus v D21, tato místa se neshlukovala do placidů nebo nových vlasových folikulů, takže KRT17 v nové epidermis v D26 zcela chyběl (obr. 3f). Vymizení KRT17 z bazálních keratinocytů u Mus spolu s naším pozorováním pokračující lokalizace v nových plakozách a vlasových folikulech u Acomys naznačuje, že základní dermální signály potřebné k indukci tvorby plakoz u Mus chybí.

Přestože přesný signál pro tvorbu plaků zůstává nejasný, existuje absolutní požadavek na signalizaci Wnt během normální tvorby folikulů12. Jaderná lokalizace proteinu LEF1 byla použita jako čidlo této indukční signalizace13. Zjistili jsme jadernou akumulaci LEF1 v regenerujících epidermálních placích, kondenzujících dermálních fibroblastech pod vlasovým zárodkem a v buňkách dermální papily a matrix (obr. 3g, h a obr. S6a). Jaderné barvení LEF1 jsme v nízkých hladinách detekovali také v některých bazálních keratinocytech bez plaků, zatímco v epidermis během hojení ran u Mus jsme jaderný LEF1 nezjistili, což naznačuje, že epidermální aktivace Wnt u Acomys může být částečně základem našeho pozorování regenerace vlasových folikulů (obr. S6b, c).

Regulace kanonické signalizace Bmp hraje roli také během indukce vlasového folikulu a diferenciace folikulárních progenitorových populací do zralého vlasového folikulu (přehled v14). Fosforylace SMAD 1, 5 a 8 (pSMAD1/5/8) je spolehlivým ukazatelem kanonické Bmp signalizace. PSMAD1/5/8 jsme detekovali v nízkých hladinách během indukce folikulu a později ve vyšších hladinách v buňkách dermální papily a matrix procházejících diferenciací ve vlasové cibulce (obr. 3i, j). Kromě toho jsme v některých regenerujících vlasových folikulech detekovali SOX2 pozitivní dermální papilu, což je v souladu s její úlohou při specifikaci různých typů vlasů během vývoje myších vlasových folikulů15 (obr. 3k). Celkově tyto výsledky ukazují, že regenerující vlasové folikuly u Acomys procházejí definovanými stádii vývoje vlasových folikulů, vykazují vysokou míru proliferace a znovu využívají molekulární dráhy využívané během embryonálního vývoje vlasových folikulů k regeneraci nových vlasových folikulů.

Kůže dospělých savců za normálních okolností není schopna regenerovat struktury odvozené od epidermu v reakci na poranění (např. žlázy a vlasové folikuly). Výjimkou je pozorování spontánní folikulárnígeneze u velkých excizních ran u králíků a nověji u laboratorních myší (C57BL6/SJ, SJL nebo smíšený kmen)16,17,18 . Králíci jsou také jedním z mála druhů savců, kteří jsou schopni regenerovat velké rány po vpichu do ucha19. Předpokládali jsme, že regenerační schopnost pozorovaná u Acomys by se mohla rozšířit i na jejich ušní tkáň. Abychom to ověřili, provedli jsme 4mm vpichy do uší obou druhů Acomys a k našemu překvapení jsme zjistili, že jsou schopni tyto velké vpichy uzavřít (obr. 4a-c a obr. S7a-c). Neporaněná ušní tkáň obsahuje kůži (epidermis a dermis), přidružené vlasové folikuly, tukové buňky, svaly a chrupavky; zjistili jsme, že Acomys jsou schopny kompletně regenerovat všechny tyto tkáně s vysokou věrností s výjimkou svalů (obr. 4b-c). Dvanáct dní po poranění jsme pozorovali hromadění buněk po obvodu rány pod epidermis, a přestože regenerace nové tkáně byla centripetální, buňky se ve větší míře hromadily na proximální straně vpichu. Regenerace vlasových folikulů a chrupavky probíhala ve vlně od proximální k distální části (obr. 4d, e) a podobně jako v kůži se i ve folikulární epidermis v uchu aktivovala signalizace Wnt (obr. S6d, e). Na rozdíl od Acomys jsme u Mus zjistili, že nejsou schopni regenerovat 4mm ušní vpichy a místo toho tvoří jizvy (obr. S8a, b). Zajímavé je, že navzdory tvorbě jizev vedla oprava ucha metodou Mus k de novo tvorbě kondenzací chrupavky distálně od řezané chrupavky, což naznačuje, že Mus může iniciovat, ale ne udržovat regenerační reakci po poranění ucha (obr. S8b).

Zůstává nejasné, zda regenerace savců probíhá tvorbou blastému, nebo je místo toho přehnanou verzí hyperplastického růstu20,21,22 . Tvorba blastémů je považována za charakteristický znak epimorfní regenerace. Jednou z charakteristik regeneračního blastému je, že obsahuje proliferující buňky a udržuje proliferaci i během regenerace23. Pozorovali jsme rozsáhlou proliferaci v celém regenerátu ucha u Acomys a překvapivě i v celé tkáni hojícího se ucha u Mus (obr. 4f, g). U Acomys jsme však zaznamenali nedostatek proliferace v distální epidermis, zatímco u Mus jsme zjistili proliferaci v celé epidermis sahající až k distálnímu hrotu (obr. 4f, g). Zatímco v uších Acomys byla proliferace zachována, v pozdějších stadiích uší Mus jsme nepozorovali téměř žádné proliferující buňky (obr. 4h, i).

Druhou charakteristikou blastému je tvorba specializovaného epidermálního signálního centra (ranná epidermis), které je nezbytné pro setrvání proliferujících blastemálních buněk v buněčném cyklu24 a je charakterizováno ztrátou epidermální stratifikace, ztrátou bazální keratinocytární polarity a absencí zralé bazální lamely25. Po reepitelizaci u Acomys jsme zaznamenali ztluštění distální epidermis, dezorganizaci bazálních keratinocytů a absenci zralé bazální membrány (obr. 4j). Naproti tomu epidermis v blízkosti amputační roviny vykazovala normální stratifikaci a měla prominující bazální membránu (obr. 4k). Naproti tomu se zdálo, že Mus po reepitelizaci tvoří epidermis rány pouze přechodně, přičemž krátkou dobu vykazovala tyto vlastnosti proporcionálně menší distální oblast (údaje nejsou uvedeny). V D12 u Mus barvení kolagenu typu IV odhalilo zralou bazální membránu pod celou epidermis hojícího se ucha (obr. 4l). Kromě toho epidermis vykazovala normální stratifikaci a správnou apikálně-bazální polaritu bazálních keratinocytů (obr. 4g, l).

Kromě trvalé proliferace a tvorby epidermis v ráně hrají klíčovou roli při podpoře proliferace a usměrňování následné diferenciace během regenerace molekuly extracelulární matrix (ECM)26. Naproti tomu molekuly jako laminin a kolagen typu I, které podporují diferenciaci, jsou v blastému během regenerace končetin obojživelníků downregulovány a jsou exprimovány v průběhu diferenciace muskuloskeletálního systému26,27 . Histologické vyšetření uší Acomys v D12 odhalilo vysoké hladiny fibronektinu (FN), trochu tenascinu-C (TN-C) obklopujícího hustě zabalené buňky, ale velmi nízké hladiny kolagenu typu I (obr. S9a-c). Kolagen typu III byl během regenerace také hojnější než kolagen typu I (obr. S9d-d‘). TN-C se omezil z oblastí, kde se začala diferencovat nová chrupavka, a v těchto diferencujících se buňkách jsme zjistili aktivaci signální dráhy Bmp v buňkách dávajících vznik nové ušní chrupavce (obr. 4o a obr. S10). Během hyperplastického růstu v uších Mus vykazovala ECM zpočátku vysoké hladiny FN a nízké hladiny TN-C stejně jako u uší Acomys, ale produkovala relativně vyšší hladiny kolagenu typu I (obr. S9e-g). Produkce kolagenu u Mus byla nejen rychlejší a hojnější, ale také vykazovala vyšší poměr kolagenu typu I a III (obr. S9h, h‘). Vzhledem k bujné produkci kolagenu typu I u Mus jsme si položili otázku, zda se rezidentní fibroblasty diferencují v myofibroblasty, které přispívají k jizvení namísto regenerace (přehled v28). Pomocí alfa hladkosvalového aktinu (αSMA) jsme zjistili, že myofibroblasty se vyskytují ve vysokém množství v celé ušní tkáni u Mus, zatímco v uších Acomys téměř zcela chyběly (obr. 4m, n). Tato data potvrzují význam ECM rány pro podporu proliferace a zároveň antagonizaci diferenciace a podporují předchozí práci, která ukázala, že předčasná tvorba kolagenu typu I antagonizuje regeneraci přívěsku27.

Naše data naznačují, že reparační regenerace ucha u Acomys je rovnováhou mezi předčasnou reformací dermis (jizvením) a udržením proliferace buněk v proregeneračním prostředí. Naproti tomu u Mus nedochází k tvorbě (nebo udržení) ranné epidermis, což se shoduje s předčasnou tvorbou bazální membrány a stratifikací epidermis. To vede ke ztrátě buněčné proliferace, zvýšenému ukládání kolagenu typu I (namísto kolagenu typu III), aktivaci myofibroblastů a nakonec k tvorbě jizvy. Ačkoli naše údaje naznačují, že regenerace ucha má podobné vlastnosti jako tvorba blastémů, pochopení molekulárních signálů potřebných k uspořádání a udržení poraněné epidermis a identifikace linie regenerujících buněk je zásadní pro řešení toho, jak regenerace u těchto zvířat probíhá. Budoucí práce zkoumající, jak jsou Acomys schopni kontrolovat fibrózu, vrhne světlo na to, jak mohou být regenerace a jizvení vyváženy tváří v tvář infekci a zánětu u volně žijících savců, a poskytuje ideální modelový systém, v němž lze zkoumat epimorfní regeneraci u savců.