MTT, žlutý tetrazol, se v živých buňkách redukuje na fialový formazan. K rozpuštění nerozpustného fialového produktu formazanu na barevný roztok se přidá solubilizační roztok (obvykle buď dimethylsulfoxid, okyselený roztok ethanolu, nebo roztok detergentu dodecylsulfátu sodného ve zředěné kyselině chlorovodíkové). Absorbance tohoto barevného roztoku může být kvantifikována měřením při určité vlnové délce (obvykle mezi 500 a 600 nm) pomocí spektrofotometru. Stupeň absorpce světla závisí na stupni koncentrace formazanu nahromaděného uvnitř buňky a na jejím povrchu. Čím větší je koncentrace formazanu, tím sytější je fialové zbarvení, a tím vyšší je absorbance.

XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid) byl navržen jako náhrada MTT, což přináší vyšší citlivost a vyšší dynamický rozsah. Vzniklé formazanové barvivo je rozpustné ve vodě, čímž odpadá závěrečný krok rozpouštění.

Vodou rozpustné tetrazoliové soli jsou novější alternativou MTT: byly vyvinuty zavedením kladných nebo záporných nábojů a hydroxyskupin na fenylový kruh tetrazoliové soli, nebo lépe se sulfonátovými skupinami přidanými přímo nebo nepřímo na fenylový kruh.

MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium) v přítomnosti fenazinmetosulfátu (PMS) vytváří formazanový produkt, který má absorpční maximum při 490 nm ve fosfátovém pufrovaném roztoku. Test MTS je často popisován jako „jednokrokový“ test MTT, který nabízí pohodlí přidání činidla přímo do buněčné kultury bez přerušovaných kroků, které jsou nutné při testu MTT. Díky tomuto pohodlí je však MTS test náchylný na kolorimetrické interference, protože přerušované kroky v MTT testu odstraňují stopy barevných sloučenin, zatímco ty zůstávají v mikrotitrační destičce v jednostupňovém MTS testu. Při použití tohoto testu je třeba zajistit přesnost a existují silné argumenty pro potvrzení výsledků MTS pomocí kvalitativních pozorování pod mikroskopem. (To je však obezřetné u všech kolorimetrických testů.)

WST (ve vodě rozpustné tetrazoliové soli) jsou řadou dalších ve vodě rozpustných barviv pro MTT testy, vyvinutých tak, aby poskytovaly různá absorpční spektra vytvořených formazanů. WST-1 a zejména WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazolium) jsou oproti MTT výhodné v tom, že se redukují mimo buňky, v kombinaci s PMS zprostředkovatelem elektronů a poskytují ve vodě rozpustný formazan. A konečně, testy WST (1) lze odečítat přímo (na rozdíl od MTT, který potřebuje rozpouštěcí krok), (2) poskytují účinnější signál než MTT a (3) snižují toxicitu pro buňky (na rozdíl od MTT propustného pro buňky a jeho nerozpustného formazanu, který se hromadí uvnitř buněk).

.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.