Metabolické inženýrství Escherichia coli pro produkci cinnamaldehydu

Výběr enzymů pro biosyntézu cinnamaldehydu

Cinnamaldehyd lze syntetizovat z l-fenylalaninu a jeho biosyntéza vyžaduje tři enzymatické reakce: (i) deaminace l-fenylalaninu na kyselinu skořicovou pomocí fenylalanin-amoniaklyázy (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) acido-thiolová ligace kyseliny skořicové na cinnamoyl-CoA pomocí 4-kumarát:CoA ligázy (4CL, EC 6.2.1.12) a (iii) redukce cinnamoyl-CoA na cinnamaldehyd cinnamoyl-CoA reduktázou (CCR, EC 1.2.1.44) (obr. 1a) . PAL je všudypřítomný enzym, který se vyskytuje v mnoha rostlinách, houbách a některých bakteriích a skrývá v sobě různé aktivity a specifika podle původu enzymu . Zkoumali jsme dva enzymy PAL, jeden z rostliny Arabidopsis thaliana (AtPAL) a druhý z bakterie Streptomyces maritimus (SmPAL), z hlediska jejich vhodnosti k produkci kyseliny skořicové v E. coli. V případě AtPAL existují čtyři isomery včetně AtPAL1 až AtPAL4 a již dříve bylo zjištěno, že většina z nich (AtPAL1, 2 a 4) má podobně vyšší aktivitu než AtPAL3 vůči l-fenylalaninu jako substrátu, proto jsme jako zástupce z rostlinného zdroje vybrali AtPAL1. Bylo zjištěno, že jejich kinetické konstanty (Km) jsou 68 a 23 μM . Každý enzym PAL s Hisovým značením byl produkován v E. coli BL21(DE3) a purifikován podle postupů popsaných v části „Metody“. Oba enzymy, AtPAL1 (78 kDa) a SmPAL (56 kDa), byly úspěšně purifikovány (Additional file 1: Figure S1). Ačkoli úroveň exprese AtPAL1 nebyla tak vysoká, aby nebyl vidět pás v pruzích 1 a 2 SDS-PAGE, pás AtPAL1 byl po afinitní chromatografii na koloně jasně vidět v pruhu 3, do kterého byl vložen koncentrovaný elut. Ekvivalentní molarita každého purifikovaného enzymu PAL byla inkubována se stejným množstvím l-fenylalaninu (jako substrátu) a titr produkce kyseliny skořicové byl kvantifikován pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) (Additional file 2: Figure S2). Jak ukazuje obr. 1b, SmPAL vykazoval výrazně vyšší aktivitu (21krát při reakci při 30 °C a 27krát při reakci při 37 °C) než AtPAL1.

Zkoumali jsme také dva různé enzymy 4CL, jeden ze Streptomyces coelicolor (ScCCL) a druhý z A. thaliana (At4CL), z hlediska jejich vhodnosti k přeměně kyseliny skořicové na skořicový aldehyd v E. coli. V případě At4CL je známo, že existuje 14 domnělých isoforem (At4CL1-At4CL14). Ze 14 isoforem mají At4CL1-3 podobnou aktivitu vůči skořici, zatímco ostatní isoformy ne . Proto jsme jako zástupce vybrali At4CL1 . Také jsme použili enzym CCR z A. thaliana (AtCCR1) pro přeměnu cinnamoyl-CoA na cinnamaldehyd . Každý enzym 4CL (At4CL1 a ScCCL ) byl testován v kombinaci s enzymem CCR z A. thaliana (AtCCR). Všechny enzymy byly úspěšně purifikovány s vysokou čistotou (Additional file 1: Figure S1). Pro porovnání enzymatické aktivity At4CL1 a ScCCL byly připraveny dvě reakce, (i) At4CL1 s AtCCR a (ii) ScCCL s AtCCR, které byly smíchány s kyselinou skořicovou jako substrátem. Po inkubaci při 30 a 37 °C byl titr cinnamaldehydu analyzován pomocí HPLC. Jak ukazuje obr. 1c, kombinace ScCCL a AtCCR vedla k vyššímu titru produkce cinnamaldehydu (4,4krát při reakci 30 °C a 10,4krát při reakci 37 °C) než kombinace At4CL1 a AtCCR. Na základě těchto výsledků jsme zkonstruovali systém biosyntézy skořicového aldehydu v E. coli, jak je popsáno níže, za použití následujících enzymů: SmPAL, ScCCL a AtCCR.

Konstrukce dráhy biosyntézy skořicového aldehydu v E. coli

Pro výrobu skořicového aldehydu v E. coli byly geny SmPAL, ScCCL a AtCCR klonovány do pTrc99A v následujícím pořadí: SmPAL, ScCCL a AtCCR (čímž vznikl pHB-CAD) (obr. 2a). E. coli W3110 nesoucí pHB-CAD byla kultivována při dvou různých teplotách (30 a 37 °C), aby byla nalezena optimální teplota pro produkci cinnamaldehydu. Exprese enzymů byla analyzována pomocí SDS-PAGE a následně pomocí western blot analýzy, jak je popsáno v části „Metody“. Při obou teplotách byly všechny enzymy dobře exprimovány a vysoce rozpustné (obr. 2b). Ačkoli byl každý enzym exprimován na jiné úrovni, exprese každého enzymu byla nepatrně lepší při 37 °C než při 30 °C. Také analýza titru cinnamaldehydu produkovaného v kultivačním médiu pomocí HPLC ukázala, že titr produkce cinnamaldehydu byl 4,5krát vyšší při 37 °C než při 30 °C (obr. 2c). Předpokládali jsme, že vyšší titr produkce cinnamaldehydu při 37 °C byl způsoben zvýšenou úrovní exprese všech biosyntetických enzymů při 37 °C aktivně, i když tyto enzymy jsou aktivní při 30 °C . Dále byly všechny kultivace pro produkci cinnamaldehydu prováděny při 37 °C.

Kmenové inženýrství pro zvýšení intracelulárního poolu l-fenylalaninu

Pro biosyntézu skořicového aldehydu je l-fenylalanin vyžadován jako základní prekurzor . Proto je pro zvýšení produkce cinnamaldehydu žádoucí zvýšit intracelulární pool l-fenylalaninu. Za tímto účelem jsme racionálně přepracovali E. coli tak, aby produkovala více l-fenylalaninu. S využitím dostupných metabolických a regulačních informací jsme E. coli W3110 upravili následujícím způsobem: (i) delece genu crr, který kóduje protein EIIAGlc související s glukózově specifickým fosfoenolpyruvátfosfotransferázovým systémem (PTS) pro zmírnění rychlosti příjmu substrátu, snížení přetékání metabolitů a obohacení prekurzorů, (ii) delece genu tyrR pro zmírnění těsné regulace regulonu TyrR, který obsahuje geny pro syntézu aromatických aminokyselin (AAA), (iii) delece genů trpE (složka anthranilát syntázy) a tyrA, aby se zabránilo ztrátě toku uhlíku do konkurenčních drah (biosyntéza l-tryptofanu a l-tyrosinu), a (iv) delece genu pykA (pyruvát kináza A), aby se obohatil prekurzor a vyrovnal tok mezi růstem a produkcí l-fenylalaninu (obr. 1). 3). Na základě výše uvedeného schématu bylo vyvinuto pět postupných knockout mutantů E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (tab. 1).

Nejprve byla deaktivována fosfoenolpyruvátová PTS specifická pro glukózu delecí genu crr v E. coli W3110, čímž vznikla E. coli YHP01. Ačkoli se tím přeruší hlavní systém pro internalizaci glukózy, YHP01 může stále růst v definovaných médiích obsahujících glukózu jako jediný zdroj uhlíku, protože mannospecifická PTS a galaktózová permeáza mohou nadále internalizovat glukózu do cytoplazmy . Obcházení PTS má za následek zvýšení zásob fosfoenolpyruvátu (PEP), který nakonec usnadňuje syntézu l-fenylalaninu . Dále jsme u kmene YHP01 odstranili gen tyrR, čímž jsme získali kmen YHP02. Protein tyrR je regulátorem regulonu tyrR, který obsahuje osm genů podílejících se na biosyntéze AAA . Jeho delece může také zvýšit zásobu l-fenylalaninu zmírněním přísné regulace genů souvisejících se syntézou AAA. Dále jsme postupně odstranili geny trpE a tyrA počínaje kmenem YHP02, čímž jsme získali kmeny YHP03 a YHP04. V cestě biosyntézy AAA dochází ke konečnému rozvětvení, v němž může být chorismát přeměněn na l-fenylalanin, l-tryptofan nebo l-tyrosin pomocí enzymů PheA, TrpE nebo TyrA. Delece genů trpE a tyrA může zabránit ztrátě uhlíku do konkurenčních drah biosyntézy l-tryptofanu a l-tyrosinu. Nakonec jsme u kmene YHP04 odstranili gen pykA, čímž jsme získali kmen YHP05. Gen pykA kóduje pyruvátkinázu A (PykA), která představuje druhý krok spotřebovávající PEP. Deletací genu pykA lze v šikimátové dráze využít více PEP a následně produkovat větší množství l-fenylalaninu. U každého kmene (YHP01-YHP05) byla delece genů ověřena pomocí PCR a elektroforézy v agarózovém gelu (Additional file 3: Figure S3).

Všechny inženýrské kmeny E. coli, včetně YHP01-YHP05 a rodičovské E. coli W3110, byly kultivovány v třepacích baňkách obsahujících semidefinovaná média a byl porovnán růst buněk a produkce l-fenylalaninu. Po 48hodinové kultivaci rostly všechny upravené kmeny o něco lépe než kmen W3110; zejména kmen E. coli YHP05 vykazoval nejvyšší hustotu buněk (obr. 4a). V předchozí studii bylo rovněž pozorováno, že inaktivace izozymů PTS a Pyk zvýšila tok uhlíku k tvorbě biomasy v důsledku efektu zachování sníženého množství meziproduktů metabolitů v důsledku sníženého příjmu a katabolismu glukózy . Analyzovali jsme také titr produkce l-fenylalaninu v supernatantu kultury pomocí HPLC. U rodičovského kmene W3110 byl titr produkce l-fenylalaninu 0,24 g/l, ale u upravených kmenů E. coli se titr l-fenylalaninu postupně zvyšoval (obr. 4a). Kmen E. coli YHP05, u kterého byly odstraněny geny crr, tyrR, trpE, tyrA a pykA, vykazoval nejvyšší titr produkce l-fenylalaninu (0,52 g/l), který byl 2,2krát vyšší než u rodičovské E. coli W3110. Proto jsme se rozhodli použít k dalšímu inženýrství kmen E. coli YHP05.

Systém nadměrné exprese založený na plazmidech pro zvýšení intracelulárního poolu l-fenylalaninu

Začínaje kmenem E. coli YHP05 byla produkce l-fenylalaninu dále zlepšena nadměrnou expresí genu založeného na plazmidech. Inhibice zpětné vazby v dráze syntézy l-fenylalaninu šikimátem a l-fenylalaninem byla snížena nadměrnou expresí izozymů nebo zavedením mutací v enzymech zapojených do šikimátové dráhy následovně: (i) nadměrnou expresí genu pro 3-deoxy-d-arabinoheptulosonát 7-fosfát (DAHP) syntázu, který je kódován v aroG s inženýrstvím (AroG8/15), (ii) nadměrnou expresí genů ydiB a aroK, které kódují šikimát dehydrogenázu a šikimát kinázu pro zvýšení toku uhlíku do šikimátové dráhy, (iii) nadměrná exprese genu pheA kódujícího CHA mutázu/prefenát dehydratázu s inženýrstvím pro zlepšení afinity k vazbě substrátu (PheAfbr, dm) a (iv) nadměrná exprese genů galP (galaktóza permeáza) a glk (glukokináza) pro usnadnění příjmu glukózy (doplňkový soubor 4: Obrázek S4).

Nejprve byl za účelem zmírnění inhibice zpětné vazby zkonstruován plazmid pTac15kG, který obsahoval upravený gen aroG8/15. V tomto plazmidu byl zkonstruován gen aroG8/15, který obsahuje gen aroG8. AroG je hlavní enzym podílející se na syntéze DAHP, ale AroG je zcela inhibován l-fenylalaninem (již od 0,1 mM) . Je známo, že zavedení dvou mutací (D146N a A202T) vedlo k rezistenci vůči zpětné inhibici, aniž by byla ovlivněna jeho vysoká specifická aktivita (AroG8/15) , proto jsme tento mutantní enzym AroG8/15 nadměrně exprimovali. Dále byly zkonstruovány dva plazmidy (pTac15kGB a pTac15kGBK) pro nadměrnou expresi genů ydiB a aroK spolu s genem aroG8/15, v tomto pořadí. Metabolický tok na šikimátové dráze může být zvýšen, pokud jsou šikimát dehydrogenáza (YdiB) a šikimát kináza (AroK) nadměrně exprimovány . Následně byl také zkonstruován plazmid pTac15kGBKA pro nadměrnou expresi genu pheA, který kóduje chorismát mutázu/prefenát dehydratázu s mutacemi. V tomto konstruktu jsme amplifikovali pouze prvních 300 aminokyselin divokého typu PheA (PheAfbr), což vylučuje regulační doménu; proto je PheAfbr slabě ovlivněna zpětnovazebnou inhibicí. Kromě toho, protože PheAfbr má vyšší hodnotu Km než PheA divokého typu, což odráží jeho sníženou afinitu k substrátu , zavedli jsme do PheAfbr dvě mutace (E159A a E232A), abychom zvýšili jeho afinitu k substrátu, čímž vznikl PheAfbr, dm . Nakonec byl zkonstruován plazmid pYHP pro dodatečnou nadměrnou expresi genů galP a glk, které kódují galaktózovou permeázu, resp. glukokinázu. Oba enzymy usnadňují příjem glukózy .

Po vytvoření pěti plazmidů, včetně pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA a pYHP (tabulka 1), byl každý plazmid transformován do E. coli YHP05. Po 48hodinové kultivaci v třepacích baňkách s polopevným médiem byl analyzován růst buněk a titr produkce l-fenylalaninu. Všechny buňky rostly dobře a zejména E. coli YHP05 nesoucí pYHP rostla s nepatrně vyšší hustotou buněk (OD600 = 9,76) než ostatní (obr. 4b). Analyzovali jsme také titr produkce l-fenylalaninu v supernatantu kultury pomocí HPLC. Nadměrná exprese genu aroG8/15 (pTac15kG) vedla k významnému zvýšení produkce l-fenylalaninu (2,25 g/l) ve srovnání s YHP05 bez plazmidu (0,52 g/l) (obr. 4b). Následná nadměrná exprese dalších genů vedla k sériovému zvýšení titru produkce l-fenylalaninu a E. coli YHP05 nesoucí pYHP vykazovala nejvyšší titr produkce l-fenylalaninu (3,91 g/L) (obr. 4b). Vlivem plazmidu pYHP došlo k významnému zvýšení produkce l-fenylalaninu až 16,4krát a 7,5krát , resp. Při kultivaci E. coli YHP05 nesoucí pYHP byla výtěžnost l-fenylalaninu na glukózu 0,270 g/g a produktivita 0,082 g/l/h (Additional file 5: Figure S5). U upravené E. coli YHP05 nesoucí pYHP se tedy výrazně zlepšil pool l-fenylalaninu. Liu a kol. dříve uvedli produkci l-fenylalaninu v E. coli až 47 g/l . Tohoto rekordu však bylo možné dosáhnout při kultivaci v krmné dávce (v měřítku 15 l) a pro účinnou produkci l-fenylalaninu do kultivačního média použili koexpresi l-fenylalaninového transportéru (YddG). V naší práci jsme YddG nezavedli, protože konečným cílem naší práce nebyla produkce l-fenylalaninu, ale produkce cinnamaldehydu. Ačkoli titr l-fenylalaninu dosažený v naší práci nebyl rekordní, domnívali jsme se, že je dostatečně vysoký pro výrobu cinnamaldehydu. Proto jsme se rozhodli použít tento upravený kmen pro produkci cinnamaldehydu.

Produkce cinnamaldehydu v upravené E. coli

Při použití upravené E. coli YHP05 nesoucí pYHP jsme nejprve zkoumali produkci kyseliny skořicové. Pro tento experiment byl zkonstruován plazmid pHB-CA, který obsahuje gen SmPAL pod IPTG indukovatelným trc promotorem (tabulka 1). E. coli YHP05 nesoucí pHB-CA i pYHP byla kultivována v baňkách po dobu 48 h a byl analyzován titr produkce kyseliny skořicové. E. coli YHP05 a E. coli W3110 nesoucí pHB-CA (bez pYHP) byly rovněž zkoumány jako kontroly. Růstové vzorce všech buněk byly podobné (obr. 5a) a E. coli W3110 a YHP05 nesoucí pHB-CA produkovaly 79 a 108 mg/l kyseliny skořicové (obr. 5b). E. coli YHP05 nesoucí pHB-CA i pYHP vykazovala výrazně lepší titr produkce (287 mg/l), který byl 3,6krát a 2,7krát vyšší než u E. coli W3110 a YHP05 nesoucí pHB-CA (obr. 5b). Podle našich nejlepších znalostí byl tento produkční titr také 1,5krát vyšší než nejvyšší hodnota (186 mg/l) zaznamenaná u E. coli . Tento výsledek jasně naznačuje, že zvýšení množství l-fenylalaninu v upraveném kmeni E. coli pozitivně přispívá ke zvýšení produkce kyseliny skořicové.

Jako hlavní cíl jsme zkoumali produkci cinnamaldehydu v inženýrském kmeni E. coli YHP05, který byl transformován s pHB-CAD a pYHP. Jako kontroly byly zkoumány také E. coli YHP05 a E. coli W3110 nesoucí pHB-CAD (bez pYHP). Růst buněk byl podobný (obr. 6a) a tři biosyntetické enzymy skořicového aldehydu byly dobře exprimovány ve všech zkoumaných buňkách (Additional file 6: Figure S6). Po 48hodinové kultivaci v baňce byly odebrány kultivační supernatanty a titry produkce cinnamaldehydu byly stanoveny pomocí HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) a E. coli YHP05 (pHB-CAD) vykazovaly titr produkce cinnamaldehydu až 2,18 a 6,3 mg/l (obr. 6b). Naopak E. coli YHP05 (pHB-CAD a pYHP) vykazovala výrazně vyšší titr produkce (75 mg/l), který byl 35krát vyšší než u E. coli W3110 (pHB-CAD).

Nematocidní aktivita cinnamaldehydu produkovaného inženýrskou E. coli

Pro vyhodnocení nematocidní aktivity cinnamaldehydu produkovaného v kultivačním médiu byly nematody, B. xylophilus, ošetřeny cinnamaldehydem podle postupů popsaných v části „Metody“ . Supernatant kultury E. coli YHP05 nesoucí pYHP a pHB-CAD byl ředěn, dokud konečná koncentrace cinnamaldehydu nebyla 60 mg/l, a nematody byly ošetřeny naředěným supernatantem kultury. Po 1 hodině přežilo pouze 26 % hlístic a po 4 hodinách méně než 18 % hlístic (obr. 7). Jako pozitivní kontrola byly nematody ošetřeny komerčně dostupným a přečištěným skořicovým aldehydem v ekvivalentní koncentraci (60 mg/l). Po 4 hodinách byly usmrceny téměř všechny hlístice (95 %). Tyto výsledky naznačily, že nematocidní aktivity komerčně zakoupeného skořicového aldehydu a vyrobeného v této studii byly podobné. Jako negativní kontrola byl testován také supernatant kultury E. coli W3110 a podle očekávání téměř všechny nematody po 4 h přežily (>92 %).

.