Stanovení organických stopových sloučenin v analýze potravin má velký význam z hlediska kvality a bezpečnosti potravin. Jak oddělení analytu od potenciálních inferencí v matrici potraviny, tak kvalitativní a kvantitativní stanovení cílové sloučeniny jsou zásadními kroky v analytické chemii potravin.
Definice
Kapalinová chromatografie (LC, zde High Performance LC – HPLC) je fyzikální separační technika pro stopovou analýzu. Je založena na interakci analytu se stacionární fází (kolona s částicemi) a mobilní fází (kapalný eluent nebo směs eluentů). Hmotnostní spektrometrie (MS) je analytický nástroj pro měření složení vzorku. MS generuje užitečné informace o molekulové hmotnosti a struktuře analytů a pomáhá při objasňování neznámých sloučenin.
Kombinace, LC/MS, LC-MS je výkonná technika, protože má velmi vysokou citlivost (až do rozsahu ppt) a specifičnost. V oblasti stopové organické analýzy se MS používá pro mnoho aplikací, ale na rozdíl od GC/MS (plynová chromatografie, spojená s hmotnostní spektrometrií) je určena pro analýzu vzorků, které obsahují netěkavé analytické cíle, obvykle s hmotností mezi 200 – 800u, které jsou tepelně labilní, vykazují vysokou polaritu nebo mají vysokou molekulovou hmotnost.
Webinář: Tento webinář pojednává o úloze, kterou může hrát testování pravosti potravin ve strategii prevence podvodů s potravinami
. Zdůrazňuje také potřebu komplexního pohledu, který zahrnuje identifikaci rizik, implementaci plánu prevence podvodů s potravinami, řízení dodavatelského řetězce, firemní kulturu bezpečnosti potravin a laboratorní testování.
Zaregistrujte se nyní
Princip práce
Zařízení LC/MS musí v zásadě provádět čtyři pracovní kroky, včetně:
- Chromatografickou separaci analytů pomocí separační kolony
- Ionizaci analytu
- Izolaci iontů a
- Identifikaci iontů
Všeobecně není triviální propojit systém HPLC s hmotnostním spektrometrem, protože problémem je přeměna rozpuštěné látky na ionty v plynné fázi. Problémem je zbavit se rozpouštědla při zachování odpovídající úrovně vakua v hmotnostním spektrometru a generovat ionty plynné fáze. Proto se složky eluující z chromatografické kolony zavádějí do hmotnostního spektrometru prostřednictvím specializovaného rozhraní.
Dva nejpoužívanější systémy ionizačního rozhraní, chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI) a ionizace elektrosprejem (ESI), se volí v závislosti na fyzikálně-chemických vlastnostech analytů (tj. polaritě a kyselosti). Ionizace probíhá za atmosférického tlaku a obě se považují za měkké ionizační metody, tj. hmotnostní spektrum poskytuje především informaci o molekulové hmotnosti, pokud se nepoužijí fragmentační techniky.
Protože sloučeniny částečně koelují z chromatografického systému, nelze provést jednoznačné přiřazení jednotlivých fragmentů pouze pomocí LC-MS, kde jsou k dispozici pouze hmotnosti molekulových iontů. K překonání tohoto problému se v současné době používá především tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS), která zahrnuje více kroků výběru hmotností nebo analýzy (LC/MS/MS nebo LC/MSn). Tyto systémy jsou schopny stanovit rezidua v nižším rozsahu ppt. Pro kvalifikaci organických molekul je nutné jiné technické uspořádání MS. Jedním z možných přístupů ke kvalifikaci je použití MS, který generuje ionty, vede je do lineární iontové pasti a poté je ukládá v radiofrekvenčním poli. Poté různé technické možnosti umožňují kvalifikaci iontů, a tedy i neznámé sloučeniny.
Použití
Od svého zavedení do rutinní analýzy zhruba před deseti lety se LC/MS prosadila ve většině oblastí analytické chemie, např. při kontrole kvality, základním a aplikovaném výzkumu a státní kontrole.
Následující příklady poskytují stručný přehled:
a) Farmacie
- Farmakokinetické studie léčiv, např. procesy degradace léčiv
- Vývoj léčiv, např. identifikace metabolitů nebo identifikace nečistot
b) Molekulární biologie
- Proteomika, např. rozsáhlé studium proteinů, zejména jejich struktury a funkce
- Metabolomika, např.např. stanovení metabolických meziproduktů, hormonů a dalších signálních molekul
c) Životní prostředí
- Odpady, např. endokrinní sloučeniny
- Půda, např. organokovové látky
d) Potraviny
- Složky, např. aminokyseliny, lipidy
- Kontaminanty, např. multireziduální analýza pesticidů, toxinů mořských plodů, veterinárních reziduí, stanovení barviv, akrylamidu, analýza mikrocystinů
- Přírodní produkty, např. terpeny, steroidy
Perfluorované tenzidy (PFC) jako příklad v analýze potravin
Základní informace
PFC je vynikajícím příkladem spojení komplexní přípravy vzorku se sofistikovanými LC/MS zařízeními a hlubokými znalostmi v analytické chemii. Jedinečné vlastnosti PFT je činí užitečnými v řadě průmyslových a komerčních výrobků, jako jsou chladicí kapaliny, polymery a jako složky ve farmaceutických přípravcích a pesticidech. Zejména perfluorované karboxyláty (např. PFOA – kyselina perfluoroktanová) a perfluorované sulfonáty (např. PFOS – kyselina perfluoroktansulfonová) se používají jako povrchově aktivní látky, např. k impregnaci textilií a koberců, v protipožárních pěnách a k ošetření proti mastnotě v papírenském průmyslu. PFC se vyrábí již více než 50 let a nyní se distribuuje po celém světě. Pokud nejsou vazby C-H plně nahrazeny vazbami C-F, což je jedna z nejpevnějších známých chemických vazeb, je degradace stále možná.
Toxikologicky jsou hodnoceny pouze PFOA a PFOS (chronicky toxické a karcinogenní), všechny ostatní homologické sloučeniny, izomery atd. zatím hodnoceny nejsou. Z fyzikálního hlediska jsou PFC perzistentní (tj. nerozložitelné) a mobilní (tj. mohou se vyluhovat z kontaminovaných půd do podzemních vod). To představuje trvalou hrozbu v souvislosti s odběrem a/nebo úpravou pitné vody. Přenosem z rostlin se navíc tyto sloučeniny dostávají do potravního řetězce.
Zjištění vysokého znečištění PFC ve dvou německých řekách v roce 2006 přitáhlo zájem veřejnosti k těmto sloučeninám.
Znečištění v roce 2006 mohlo pocházet z organických kalů, které byly použity jako hnojivo pro zemědělské účely. Ukázalo se, že půda obsahuje až 600 µg PFC/kg, což způsobilo kontaminaci pitné vody a zásobovacích zařízení. Kontaminaci PFC dosud ohlásilo sedm německých spolkových zemí.
Fraunhoferův institut IME
Jednou z hlavních kompetencí Fraunhoferova institutu pro molekulární biologii a aplikovanou ekologii je vývoj proveditelných a spolehlivých metod pro identifikaci a analýzu chemických kontaminantů v potravinách a matricích životního prostředí.
Od roku 1999 realizuje Fraunhoferův institut IME projekty měření kontaminace PFC v různých matricích životního prostředí. Tato práce byla prováděna na objednávku průmyslových partnerů a zaměřovala se zejména na karboxyláty PFC a sulfonáty PFC. Další šetření byla prováděna jménem monitorovacího programu německé Spolkové banky vzorků životního prostředí, který zahrnoval také vzorky lidské krve. V roce 2005 byla provedena první šetření v oblasti potravinářských výrobků a v roce 2006 byly výsledky vybraných vzorků potravin (např. mateřské mléko, hranolky) diskutovány i v médiích. V roce 2007 byly provedeny rozsáhlejší projekty zaměřené na přenos rostlin, brambor a výrobků, lidské matrice (krev a mateřské mléko) a také vzorky životního prostředí (např. odpadní voda, kaly a půda).
Analytické řešení
Pro pokrytí všech možných matric vzorků byly použity tři různé přípravy vzorků:
- IPE (párová iontová extrakce). Použití iontového párovacího činidla tetra-n-butylamonium hydrogensulfátu s následnou extrakcí v pevné kapalině (např. vzorky životního prostředí)
- AAE (kyselá alkalická extrakce). Odstranění lipidů hexanem při pH 14 (kapalný roztok amoniaku), úprava na pH 1 kyselinou chlorovodíkovou a extrakce terc-butylmethyletherem (např. mateřské mléko)
- SPE (extrakce na pevné fázi, v současnosti nejcitovanější metoda) s náplněmi různé polarity v závislosti na iontovém charakteru PFC v pufrovaném prostředí (např.např. brambory)
Důrazně se doporučuje použití vnitřních standardů pro kalibraci; v současné době naše metody zahrnují devět hmotnostně značených standardů PFC. Před zavedením vzorků do LC/MS je třeba zkontrolovat samotné zařízení, zda neobsahuje náhradní díly potažené teflonem, protože obsahují emitující PFC, které ovlivní výsledky nereprodukovatelným způsobem. Tyto díly je třeba vyměnit, což vyžaduje vynikající znalost součástí LC/MS.
Analytický příklad
Pro analýzy syrových brambor a výrobků z brambor jsme upravili naši LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 s Quattro Ultima Pt v negativním režimu elektrospreje, obojí Waters; 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2) kolona, Phenomenex) systém pro cílové hmotnosti 9 perfluorokarboxylových kyselin (C4 – C12) a 3 perfluorosulfonových kyselin (C4, C6, C8) s použitím referenčních materiálů značených 13C (LOQ 0.5 µg/Kg) po přípravě vzorku pomocí SPE.
PFC vykazovaly rozdílnou distribuci v syrových bramborách a v bramborových výrobcích (tabulka 1), což umožňuje předpokládat kontaminaci během zpracování a také kontaminaci půdy. To lze podpořit naším šetřením PFC hranolků z roku 2006, kdy jsme analyzovali hranolky z restaurací rychlého občerstvení a zjistili jsme až 2,8 µg PFOA/kg a až 0,9 µg PFOS/kg.
Analytický výhled
Fraunhoferův institut IME má značné odborné znalosti a zkušenosti s analýzou PFC, které by se mohly uplatnit v mnoha oblastech kontaminace životního prostředí / potravin PFC, které dosud nebyly zkoumány. Mezi důležité oblasti budoucího výzkumu PFC může patřit zvýšení počtu analytů, mnoho PFC s krátkým a dlouhým řetězcem je již zahrnuto v našem studijním programu, ale naše analytické schopnosti by mohly být vylepšeny zahrnutím dalších PFC. Další PFC musí být identifikovány pomocí LC/MS, protože komerční standardy nejsou k dispozici. To povede ke konsolidovaným zjištěním o prekurzorech, cestách kontaminace potravin a rozkladu během zpracování potravin.
.