Integrovaná syntéza nukleotidů a nukleosidů ovlivněných aminokyselinami

Současná tvorba glykosylačních produktů

Tvorba nukleosidových a nukleotidových struktur z jednoduchých prekurzorů byla dosažena současně se třemi nukleobázami dehydratačními reakcemi. To je na rozdíl od předchozích prací v této oblasti, kde byly podmínky optimalizovány tak, aby upřednostňovaly specifické produkty24,25,26. V typickém glykosylačním experimentu byly adenin a P-ribosa zahřívány při teplotě 90 °C po dobu 5 h při pH 2,5. Při kombinaci adeninu a P-ribosy jsme pozorovali vznik nukleotidu adeninmonofosfátu (AMP) (a jeho isomerů). Extrahované iontové chromatogramy (EIC) získané z HPLC-MS analýzy produktů odhalily několik píků s m/z shodnými + a + (doplňkové obr. 13-15). Porovnání se standardy potvrdilo, že AMP odpovídá pík nalezený při RT = 4,2 min (doplňkové obr. 5, 6); ostatní hlavní píky mohou odpovídat izomerům AMP, jako je N6-ribosylovaný izomer. Za účelem potvrzení této skutečnosti byla provedena hydrolýzní reakce v přítomnosti NaOH (0,1 M) ve snaze odlišit jednotlivé izomery, vzhledem k tomu, že N6-ribosylovaný izomer je náchylnější k hydrolýze. Lze však pozorovat mírné narušení píků, což ztěžuje potvrzení identity N6-ribosylovaného isomeru. Poté jsme analyzovali dva čisté standardy dvou různých izomerů (adenosin 3′-monofosfát a adenosin 5′-monofosfát monohydrát) jednotlivě a ve směsi, abychom objasnili eluční profil izomerů (doplňkové obr. 148, 149). U standardní směsi lze pozorovat posun retenčního času, který poskytuje lepší korelaci s elucí těchto sloučenin v reálném vzorku. Přestože je obtížné rozlišit izomery, můžeme porovnáním elučního profilu standardní směsi se skutečným vzorkem potvrdit přítomnost nejméně dvou izomerů v rámci produktů AMP. Nyní je zřejmé, že vznik různých izomerů (doplňkový obr. 12) je možným důvodem eluce nukleotidů se stejnými hmotnostmi v různých retenčních časech. Navíc MS/MS analýza produktů naší reakce ukazuje fragmentaci AMP (a jeho izomerů) na adenin (m/z = 136,0617 ± 0,01) (doplňkový obr. 20); to je v souladu s fragmentací kanonického standardu AMP. Námi navrhovaný reakční mechanismus spočívá ve vzniku glykosidické vazby mezi 1′-OH skupinou ribózy a aminoskupinou adeninu (viz Doplňkový obr. 12).

Časový průběh reakcí ukazuje, že hlavní hnací silou tvorby glykosylačních produktů je odpařování vody, které ukazuje výrazný nárůst tvorby nukleosidových a nukleotidových struktur v časovém období mezi 2 a 4 h (obr. 2a). To odpovídá časovému rozmezí, kdy se objem vzorku drasticky zmenší a činidla jsou extrémně koncentrovaná. Po 5-6 h reakce dosáhne vzorek sucha a rychlost reakce (následovaná intenzitou při měření HPLC-MS) se ustálí. Kromě AMP byly produkty obsahující glykosidické vazby, včetně cyklických nukleotidů (tj. cAMP)27 a nukleosidů (tj. adenosinu), detekovány pomocí RP-HPLC-MS, MS/MS a testovány na tvorbu 1,N6-etheno derivátů28,29 , což bylo potvrzeno porovnáním se standardy (obr. 2, doplňkové obr. 7-11, doplňkové obr. 23-27). Retenční časy 2′,3′-cAMP a 3′,5′-cAMP kanonických standardů neodpovídaly retenčním časům EIC píků ve vzorku. Rozložení hmotností (+; +) a fragmentační vzorce (+) však byly totožné (doplňkové obr. 16-21). Tyto výsledky ukazují, že ačkoli se tvoří cyklické struktury, kanonický cAMP není hlavním produktem. Srovnání s analytickým standardem adenosinu rovněž ukazuje, že při kondenzační reakci P-ribosy a adeninu vzniká adenosin spolu s řadou izomerních forem (doplňkové obr. 18-22). Zatímco kanonické formy AMP a adenosinu byly v těchto experimentech potvrzeny, nebyly hlavními produkty dehydratační reakce.

Pokud byl fosfát dodáván samostatně jako pyrofosfát a reagoval s adeninem a ribózou, byla detekována sloučenina s hmotností adenosinu a bylo detekováno malé množství AMP a cAMP a adenosin se tvořil i tehdy, když nebyl přítomen žádný zdroj fosfátu (doplňkové obr. 33-41). Stojí za zmínku, že jsme se v našich studiích záměrně zaměřili na identifikaci fosforylovaných produktů (izomerů AMP a cAMP) a menší pozornost jsme věnovali identifikaci fosforylovaných produktů, které nejsou izomery AMP a cAMP30,31,32 . Navrhujeme vznik glykosidické vazby mezi hydroxylovou skupinou ribózy a aminoskupinou adeninu, který je vyvolán ztrátou molekuly vody odpařením. Relativní reaktivita primární a sekundární aminové skupiny v adeninu je dobře prostudována33 a bez aktivace nebo přítomnosti ochranné skupiny je obvykle upřednostňována glykosidická vazba na primárním aminu. Proto se neočekává, že kanonický isomer adenosinu/AMP bude hlavním produktem, protože by vyžadoval reakci výhradně na sekundárním aminu. Reaktivita na místě sekundárního aminu je však dostatečně vysoká, aby kanonické isomery vznikaly, i když ne jako hlavní produkt. U jiných nukleobází, jako je guanin, je přístupných aminových skupin ještě více a potenciál pro vznik isomerních produktů je větší. Reaktivita ribózy pravděpodobně probíhá převážně přes anomerní polohu, což vede k menšímu počtu možných isomerů, ačkoli lze pozorovat některé další méně významné produkty.

Byla také zkoumána reaktivita dalších kanonických nukleobází (cytosinu, guaninu a thyminu) s P-ribózou. Po dehydratační reakci guaninu a cytosinu s P-ribosou byly zjištěny hmotnosti odpovídající nukleosidovým a nukleotidovým strukturám (obr. 3 a doplňkové obr. 50-64). Glykosylační struktury guaninu se tvořily v relativně malé míře, pravděpodobně v důsledku omezené rozpustnosti guaninu při nízkém pH. Množství produktů naměřených pro 5-methyluridin monofosfát (m5UMP) a 5-methyluridin (thyminový nukleosid) bylo ještě nižší než jejich ekvivalenty z guaninu a cytosinu (obr. 3 a doplňkové obr. 65, 66). Tyto výsledky lze vysvětlit přítomností primární aminoskupiny v guaninu a cytosinu, která v thyminu chybí. Všechny tři nukleobáze sice mají sekundární aminoskupiny, ty jsou však při tvorbě glykosidických vazeb méně reaktivní. Proto je tvorba nukleosidových a nukleotidových struktur prostřednictvím sekundární aminové reakce, která je nutná pro tvorbu kanonických produktů glykosylace, u nukleobází, kde jsou k dispozici primární aminy, nevýhodná. To má zajímavý důsledek pro přijetí chemie nukleových kyselin při vzniku života, protože to naznačuje, že kanonické nukleotidy mohly být zpočátku nevhodné, dokud se neobjevily další biochemické mechanismy, které by zvýšily selektivitu vůči správným izomerům. Proto se podle očekávání v našich experimentech sice tvořily kanonické nukleotidové a nukleosidové produkty cytosinu a guaninu, ale neodpovídaly hlavním pozorovaným píkům (doplňkové obr. 42-49). Kombinací těchto dvou pozorování (rozdílné retenční časy, ale stejné rozložení hmotností jako u kanonických standardů v EIC) můžeme dojít k závěru, že nukleotidové a nukleosidové druhy vzniklé dehydratační reakcí guaninu/cytosinu s P-ribosou byly především izomerními druhy kanonických nukleotidů a nukleosidů (některé možné struktury jsou uvedeny na doplňkových obr. 50, 51).

Typicky byla tvorba nukleotidových struktur prováděna za specifických podmínek v závislosti na použité nukleobáze, zaměřených na konkrétní reakční produkt. V alternativním přístupu jsme se rozhodli zahrnout do reakce s P-ribózou více nukleobází současně. Naším cílem bylo zjistit, zda tvorba produktů s více nukleobázami za stejných reakčních podmínek poskytne směs produktů, nebo zda bude dominovat jeden. Tuto reakci jsme prováděli tak, že jsme do reakční nádoby společně s P-ribosou zahrnuli dvě nebo tři nukleobasy (adenin, guanin a cytosin) současně. Byla získána směs produktů glykosylace zahrnující nukleotidy (AMP, GMP a CMP) a příslušné cyklické nukleotidy (cAMP, cGMP a cCMP) a produkty nukleosidů (adenosin, guanosin a cytidin) (doplňkové obr. 67-95). Produkty glykosylace guaninu vznikaly s nižším výtěžkem než produkty adeninu a cytosinu, jak se očekávalo v důsledku nízké rozpustnosti guaninu v kyselém prostředí.

Výměna nukleobází

Výměna nukleobází byla pozorována při zahřívání Na+AMP po dobu 5 h při 90 °C v kyselém vodném prostředí s cytosinem nebo guaninem. Nukleobázová výměna vedla k tvorbě nukleotidových (CMP nebo GMP), cyklických nukleotidových (cCMP nebo cGMP) a nukleosidových (cytidin nebo guanosin) struktur (viz doplňkové obr. 96-102 a doplňková tabulka 1 pro semikvantitativní výtěžky). V tomto experimentu vykazovaly CMP a cytidin rostoucí trend intenzity, zatímco cCMP dosáhl maximální intenzity při 12,5 mM a poté klesal až do intenzity 4,0 × 104 AU (doplňkové obr. 102a a 155-158). Při koncentraci cytosinu 37,5 mM bylo zjištěno, že sloučeninou s vyšší intenzitou je CMP a intenzity naměřené pro cCMP a cytidin byly téměř stejné. V EIC CMP a cCMP byly pozorovány dvě hlavní izomerní formy. V případě CMP byly zjištěny +, + a + hmotnosti, zatímco cCMP vykazoval +, + a + v rámci příslušných hmotnostních distribucí. V případě cytidinu byl hlavním detekovaným píkem +. Tato rozložení hmotností odpovídala rozložení pozorovanému u standardů. Retenční časy hlavních isomerů však neodpovídaly kanonickému CMP a cytidinu. Při reakci AMP se zvyšující se koncentrací guaninu (doplňkový obr. 102b) dosáhly všechny tři produkty glykosylace (GMP, cGMP a guanosin) maximální hodnoty při koncentraci guaninu 2,5 mM (doplňkové obr. 160-162). Tyto výsledky byly důsledkem omezené rozpustnosti guaninu při kyselém pH, takže i když bylo do reakční nádoby přidáno více guaninu, účinná koncentrace v roztoku byla stejná. Po dosažení maximální hodnoty byla intenzita cGMP a guanosinu konstantní, což bylo způsobeno špatnou rozpustností guaninu. Při = 37,5 mM byl pozorován pouze malý nárůst intenzity všech tří produktů glykosylace guaninu, což může souviset s větší přítomností guaninu v roztoku v důsledku vysoké přidané koncentrace. V EIC GMP byla pozorována široká oblast bez dobře definovaných píků, ačkoli vynikly dva hlavní píky. + byl jediným chemickým druhem, který souvisel se sloučeninami guaninu a byl zjištěn v rozložení hmotností na jeho EIC. Při extrakci EIC cGMP z MS dat byly pozorovány čtyři píky seskupené do dvojic a hmotnostní distribuce vykazovala + a + druhy. Na druhé straně EIC guanosinu představoval tři píky, z nichž nejintenzivnější vykazoval přítomnost + v jeho hmotnostní distribuci.

Tvorba produktů glykosylace cytosinu a guaninu prokázala, že za našich reakčních podmínek došlo ke štěpení glykosidické vazby AMP. Při analýze EIC AMP, cAMP a adenosinu bylo v každém chromatogramu pozorováno několik píků, což podporuje teorii, že během dehydratační reakce dochází k dynamické hydrolýze/tvorbě glykosidických vazeb34. Byly rovněž zkoumány reakce cytosinových a guaninových nukleotidů s adeninem. V případě dehydratační reakce CMP a adeninu nebylo možné pozorovat žádné produkty odpovídající výměně nukleobází (doplňkové obr. 103-108/a). Produkty glykosylace adeninu však byly jasně detekovány při reakci GMP s adeninem (doplňkové obr. 105-108/b). Je to proto, že hydrolýza glykosidických vazeb v GMP je za stejných reakčních podmínek snadnější než u CMP34. Provedli jsme také reakci výměny nukleobází s UMP a adeninem, abychom ji mohli porovnat s přímým pyrimidinovým analogem adeninu (doplňkový obr. 109). Výsledky se více podobaly výtěžkům CMP uvedeným na doplňkovém obr. 108 než výtěžkům GMP, přičemž jsme získali velmi nízký výtěžek produktů glykosylace adeninu v reakci s UMP, který neumožňuje detekci AMP a cAMP.

Vliv aminokyselin na distribuci produktů glykosylace

Jak již bylo uvedeno, aminokyseliny, nukleotidy a jejich stavební kameny mohly být na rané Zemi přítomny současně. Proto se v prebiotickém prostředí mohly vyskytovat produkty kopolymerizační reakce, nebo dokonce produkty vzniklé v důsledku určitého katalytického působení jednoho typu polymeru na druhý. Pro studium ko-reaktivity nukleotidových stavebních bloků a aminokyselin při jednopotové dehydrataci byl do dehydratačních reakcí P-ribózy a příslušných nukleobází zahrnut glycin, nejjednodušší aminokyselina. Začlenění glycinu mělo zřetelný vliv na tvorbu produktů glykosylace, což způsobilo snížení celkového výtěžku produktů s hmotností izomerů AMP, izomerů cAMP a adenosinu (obr. 4a a doplňkové obr. 28-32). To naznačuje, že glycin hraje roli buď při spotřebovávání nukleotidových stavebních bloků (P-ribosy a/nebo adeninu) prostřednictvím vedlejší reakce, nebo že se připojuje ke struktuře produktu, čímž mění jeho hmotnost. Analýza EIC pro tyto reakce odhaluje píky odpovídající hmotnosti glycinových aduktů (tj. AMP-Gly, cAMP-Gly, adenosin-Gly a adenin-Gly) (doplňkové obr. 115-122), ačkoli tyto vedlejší produkty nevznikají v dostatečném množství, aby vysvětlily všechny pozorované změny. Adukty glycinu byly také potvrzeny použitím deuterovaného glycinu jako výchozího materiálu spolu s P-ribózou a adeninem, což způsobilo změny v izotopovém rozložení hmotností aduktů (doplňkové obr. 123, 124). Maximální semikvantitativní výtěžek 59 % byl získán pro tvorbu produktů glykosylace (izomerů AMP, cyklických izomerů AMP a adenosinu) v reakci P-ribózy a adeninu; avšak pouze 46% výtěžek byl získán, pokud byl v reakčním prostředí přítomen také glycin (doplňkový obr. 144). Kvantifikovat výtěžky všech možných jednotlivých izomerů je technicky obtížné, ale semikvantitativní výtěžky některých izomerů bylo možné stanovit pomocí čistých standardů: V nepřítomnosti glycinu byl zjištěn výtěžek adenosin 5′-monofosfátu 38,7 % a adenosin 2′,3′-cyklického monofosfátu 18,2 %, zatímco v přítomnosti glycinu byl výtěžek u obou izomerů výrazně snížen (<2 %).

Glycin také ovlivnil distribuci izomerních druhů a byly pozorovány jasné rozdíly ve srovnání s chromatogramem základního píku (BPC) z reakce P-ribózy a adeninu v přítomnosti a nepřítomnosti glycinu (obr. 4b a doplňkové obr. 110-114). Tyto údaje naznačují přítomnost různých chemických druhů a z toho vyplývající změnu rozložení hmotností mezi reakcemi s glycinem a bez něj. Poté byly analyzovány jednotlivé EIC pro každý produkt adeninové glykosylace, což vedlo k tomu, že byly pozorovány jasné rozdíly v relativních intenzitách píků po přidání glycinu. Tyto výsledky jasně ukazují, že glycin má selektivní vliv na to, které izomerní formy se přednostně tvoří. Je známo, že glycin snadno reaguje s jinými aminy za dehydratačních podmínek12 a je pravděpodobné, že reaguje s primárními aminy nukleobází. Hybridní vedlejší produkty zahrnující glycin (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosin, Gly-Adenin) byly detekovány ve výtěžku ~1 % (doplňkový obr. 145), nicméně toto malé procento má významný vliv na distribuci izomerních produktů adeninové glykosylace (viz doplňkové obr. 146, 147). Změna izotopového rozložení hmotností hybridních produktů byla zjištěna (Doplňkové obr. 123, 124), když byl do dehydratační reakce zahrnut deuterovaný glycin, což potvrzuje zahrnutí glycinu do hybridních struktur.

Podobný vliv na rozložení izomerů byl pozorován také při reakci P-ribózy s cytosinem/guaninem v přítomnosti glycinu (obr. 4c, Doplňkové obr. 125-140). Maximální intenzity jednotlivých izomerů se snížily (GMP, CMP, cGMP, cCMP, guanosin a cytidin), přičemž bylo ovlivněno i rozložení relativních intenzit. Rozdíly mezi experimenty byly důsledně ověřeny pomocí statistické metody, jako je shluková analýza dat EIC, která segmentuje vzorky v přítomnosti a nepřítomnosti glycinu do složených skupin/klastrů se společnými charakteristikami (obr. 5). Cílem shlukové analýzy v této studii je seskupit data (tj. tvorba struktury nukleotidů a nukleosidů) do složkových skupin se společnými charakteristikami (např. přídavek glycinu versus bez glycinu). Tato analýza by měla prokázat vysokou vnitřní homogenitu uvnitř shluků/skupin a vysokou vnější heterogenitu mezi shluky/skupinami. Na obr. 5 je zobrazen dendrogram s vazbou „Wards „35 . Pro identifikaci shluků v dendrogramu jsme spektra obarvili podle přítomnosti glycinu (glycin – červená, bez glycinu – černá, prázdná – modrá). Jak lze pozorovat, vzorky obsahující glycin se shlukují dohromady. Jeden shluk odpovídá P-ribose + adeninu + glycinu (tři vzorky), který je oddělen od vzorků bez glycinu. Druhý shluk odpovídá P-ribóze + guaninu + glycinu a P-ribóze + cytosinu + glycinu. Vzorky obsahující adenin se oddělují do většího shluku, který se odlišuje od ostatních vzorků, což ukazuje na silný vliv adeninu v reakci. Ve skutečnosti existuje řada dalších možných produktů a reakcí, které by mohly probíhat za provedených reakčních podmínek (podrobněji viz doplňková poznámka 1 a doplňkové obr. 150-162).

Do dehydratační reakce adeninu s P-ribosou byly zahrnuty také další aminokyseliny, aby se ověřilo, zda budou mít také nějaký vliv na izomerní distribuci produktů glykosylace (doplňkové obr. 141-143). Šest aminokyselin vybraných pro tuto studii (arginin, kyselina glutamová, threonin, methionin, fenylalanin a tryptofan) má různé postranní řetězce s odlišnou chemickou povahou a funkčními skupinami. Při porovnání výsledků s údaji získanými z reakce pouze P-ribózy a adeninu byly ve všech reakcích pozorovány změny v distribuci izomerů AMP, s výjimkou tryptofanu, což lze přičíst konformačním omezením v důsledku přítomnosti postranního řetězce tryptofanu na bázi indolu. Při analýze EIC cAMP byly zaznamenány menší změny v relativní intenzitě izomerních píků. Zřetelný rozdíl v EIC adenosinu byl však pozorován pouze u reakcí zahrnujících fenylalanin a threonin

.