Výsledky a diskuse
Dva způsoby štěpení DNA R.KpnI v přítomnosti Mg2+
R.KpnI je na rozdíl od většiny ostatních REáz vysoce promiskuitní REáza v reakcích katalyzovaných Mg2+ (11, 12). Na obr. 1 A je znázorněn charakteristický průběh štěpení R.KpnI v rozsahu koncentrací Mg2+. Při nižších koncentracích kovového iontu (50-500 μM) bylo pozorováno pouze štěpení kognátní sekvence (dráhy 2-5). Při koncentracích Mg2+ >500 μM však bylo patrné promiskuitní štěpení (dráhy 6-9). Specifický a promiskuitní způsob štěpení R.KpnI v závislosti na koncentraci Mg2+ byl doložen analýzou štěpení oligonukleotidů. Oligonukleotidový substrát obsahující kanonickou sekvenci byl účinně štěpen R.KpnI i při 20 μM Mg2+. Naproti tomu nekanonické sekvence byly účinně štěpeny pouze při >500 μM Mg2+ . Tyto výsledky naznačují, že R.KpnI vykazuje dva různé profily aktivace kovem – jeden pro kanonické a druhý pro nekanonické substráty DNA. Enzym sleduje hyperbolický profil aktivace kovem pro kanonický substrát a sigmoidální vzorec pro nekanonický substrát (obr. 1 B). Tato data byla podrobena analýze Hillova grafu (obr. S2; a viz SI Text ) a Hillův koeficient pro vazbu kovových iontů je uveden v tabulce 1. Analýza Hillova grafu odhalila vazbu dalšího kovového iontu na enzym a jeho roli při štěpení nekanonických sekvencí. Ukázalo se tedy, že k vyvolání promiskuitního štěpení enzymem je nutný nábor dalšího kovového iontu v blízkosti nebo ve vzdálenosti od aktivního místa enzymu. V takovém případě by mutace zbytků zapojených do koordinace kovového iontu v druhém místě měla zrušit promiskuitní aktivitu, což by vedlo k vysoce sekvenčně specifickému enzymu. Tuto hypotézu jsme testovali.