DISCUSSION
Citrobacter je významnou příčinou oportunních infekcí; C. diversus je spojován s přibližně 40 % prezentovaných případů, zatímco C. freundiireprezentuje přibližně 29 % (11). Citrobacterspp. způsobují neonatální meningitidu a mají neobvyklý sklon způsobovat mozkové abscesy (8, 14). PatogenezeCitrobacter spp. způsobujících meningitidu a mozkový absces není dobře charakterizována; stejně jako u jiných bakterií způsobujících meningitidu však musí dojít k průniku hematoencefalickou bariérou. Tato studie byla provedena s cílem lépe porozumět potenciálním interakcímCitrobacter s hematoencefalickou bariérou. Jako modelová bakterie pro tyto studie byla vybrána C. freundii, protože genetika bakterie je lépe definována a je k dispozici genomová knihovna pro případné studie týkající se molekulárního základu invaze a replikace citrobakterií v HBMEC. Pokusy provedené s izolátem C. diversus v mozkomíšním moku přinesly podobné výsledky (údaje nejsou uvedeny), což naznačuje, že frekvence a mechanismus invaze do HBMEC mohou být u těchto dvou druhů podobné.
Krevně-mozková bariéra je složitá struktura, která se skládá z epitelu choroidálního plexu a endotelu mozkových kapilár. Přítomnost těsných spojů a nízká pinocytotická aktivita endotelových buněk vede k omezení průchodu makroprvků hematoencefalickou bariérou. V současné době není známo, kudy v hematoencefalické bariéře C. freundii proniká, ale u modelu experimentální hematogenní citrobakterové meningitidy u kojenců na potkanech bylo zjištěno vzácné postižení cévního plexu (16). Kromě toho endoteliální mikrovaskulární buňky pokrývají největší povrch hematoencefalické bariéry a bylo prokázáno, že jiné bakterie způsobující meningitidu in vitro napadají mikrovaskulární endoteliální buňky (13, 20, 25). Proto jsme pro naši studii vybrali HBMEC. Testy invaze na tkáňových kulturách a studie TEM poskytly důkaz, že C. freundii invaduje HBMEC. Výsledky invazních testů provedených v přítomnosti různých eukaryotických buněčných inhibitorů naznačují, že invaze C. freundii do HBMEC je proces závislý na mikrofilamentech, mikrotubulech, syntéze de novo proteinů a acidifikaci endosomů. Testy prodloužené invaze prokázaly, že C. freundii může přežívat a replikovat se intracelulárně po delší dobu in vitro. Analýzy TEM odhalily, že intracelulární umístění jednotlivých a vícenásobných buněk C. freundii se nachází ve strukturách podobných vakuolám s jednou membránou. Transwellovy experimenty prokázaly, žeC. freundii může procházet polarizovanou monovrstvou HBMEC, zatímco neinvazivní E. coli nikoli. Naše předběžné údaje navíc ukazují, že C. freundii proniká přes hematoencefalickou bariéru v modelu experimentální hematogenní meningitidy u novorozených potkanů (21). Celkově tato zjištění naznačují, že C. freundii invaduje do vakuol, pravděpodobně se replikuje, transcytuje přes HBMEC, uvolňuje se do bazolaterální strany, a tak proniká hematoencefalickou bariérou.
Invaze C. freundii do eukaryotických buněk již byla popsána (22, 35). Toto je však první zpráva o invazi C. freundii do HBMEC. Je zajímavé, že eukaryotické požadavky na invazi C. freundii jsou stejně rozmanité jako typy buněk, které C. freundii invaduje. Například bylo prokázáno, že inhibitor MDC s klatrinovým pláštěm inhibuje invazi C. freundii do všech ostatních testovaných buněčných typů (např. lidských cévních, střevních a močového měchýře) s výjimkou HBMEC, jak bylo prokázáno v této studii. Kromě toho jiné dosud charakterizované bakterie způsobující meningitidu vstupují do HBMEC cestou (cestami), která je závislá na mikrotubulech a je citlivá na MDC (20, 24, 27). Bylo prokázáno, že inhibitory MDC a ouabain s klathrinovým pláštěm neinhibují všechny receptory; je tedy možné, že receptor nezbytný pro invazi C. freundii do HBMEC není inhibitorem MDC nebo ouabainu ovlivněn. Ačkoli dosud shromážděné důkazy naznačují, že ke vstupu C. freundii do HBMEC nemusí dojít cestou zprostředkovanou receptorem citlivým na MDC nebo oabain, zdá se, že je nutná acidifikace endosomů a syntéza proteinů de novo. Dostupné údaje naznačují dva možné scénáře. Okyselení endosomů může být nutné jako spouštěč prostředí pro přežití intracelulárních bakterií. Podobné požadavky byly charakterizovány pro invazi salmonel do epitelu (26). Alternativně může být acidifikace endozomu a syntéza proteinů nutná pro oddělení komplexu ligand-receptor, syntézu receptoru a/nebo prezentaci receptoru na povrchu HBMEC, aby mohlo dojít k invazi C. freundii. Tento druhý scénář připomíná jiné invazivní patogeny, kde je kontakt životaschopného organismu nutný pro modulaci adhezních molekul eukaryotických buněk, které jsou nezbytné pro invazi (např. Streptococcus pneumoniae a receptor pro destičkový aktivační faktor) (2). V naší laboratoři probíhají experimenty s cílem rozlišit tyto navrhované scénáře.
Invazivní testy prováděné v přítomnosti inhibitorů mikrotubulů (depolymerizačních i stabilizačních látek) významně snižovaly schopnost HBMEC přijímat C. freundii. Konfokální mikroskopické experimenty s anti-α-tubulinovými protilátkami ukázaly, že mikrotubuly se po kontaktu HBMEC s C. freundii shlukují. Agregace mikrotubulů byla závislá na čase; po 5 minutách nebyla pozorována žádná agregace, po 15 minutách byla pozorována jen málo a zřetelná agregace byla pozorována po 30 minutách inkubace C. freundii s HBMEC. Tato agregace mikrotubulů byla inhibována, pokud byly buňky ošetřeny buď inhibitory mikrotubulů, nebo látkami inhibujícími mikrofilamenty. Zajímavé je, že vzor barvení mikrotubulární agregace nebyl kolokalizován s vazbou bakterií a oblasti HBMEC, které nevykazovaly vazbu C. freundii, rovněž vykazovaly výrazné shlukování mikrotubulů. To naznačuje, že kontakt bakterií s HBMEC může globálně stimulovat agregaci mikrotubulů. Zda je agregace mikrotubulů důsledkem vylučovaného bakteriálního faktoru nebo parakrinní reakce na vazbu bakterií na HBMEC, se teprve ukáže. Kromě toho může agregace mikrotubulů v reakci na vazbu C. freundii souviset s postulovanou prezentací receptoru prostřednictvím syntézy proteinů de novo a acidifikace endosomů. Již dříve bylo prokázáno, že transport mnoha receptorů na buněčný povrch a z něj je závislý na mikrotubulech (10). Proto je jedním z vysvětlení inhibičního účinku inhibitorů mikrotubulů na vstupC. freundii do HBMEC to, že tyto látky mohou snížit počet receptorů HBMEC, které zprostředkovávají invazi C. freundii. Probíhají experimenty, které mají tyto možnosti rozlišit.
Mikrotubuly se již dříve ukázaly jako nezbytné pro invazi mnoha patogenů (např. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropatogenní a enterohemoragické E. coli a Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Obecně se má za to, že ačkoli tyto patogeny mohou vstupovat cestami závislými na mikrotubulech, obvykle se nereplikují intracelulárně (6). Údaje získané v této studii z rozšířených invazních testů a TEM analýzy naznačují, žeC. freundii může být výjimkou z tohoto zobecnění. Na rozdíl od toho, co bylo popsáno u jiné intravakuolárně se množící bakterie, Legionella pneumophila(12), se v těsné blízkosti bakterií nevyskytovaly žádné mitochondrie ani ribozomy. To naznačuje, že C. freundii možná nevyužívá tyto organely k přímému získávání energie nebo že nábor specifických proteinů hostitelské buňky nemusí být nutný pro intracelulární přežití a množení (jako v případě L. pneumophila). Pro infekce centrálního nervového systému mají zvláštní význam jiné bakterie způsobující meningitidu, jako jsou E. coli K1, GBS a S. pneumoniae, u nichž bylo podobně prokázáno, že invadují (1, 13, 25) nebo invadují a transcytují (20, 27) BMEC; nebylo však zjištěno, že by se tyto organismy replikovaly v HBMEC. Jak bylo popsáno výše,u citrobakterové meningitidy byla dokumentována vysoká frekvence tvorby mozkových abscesů. Zda je replikace ve vakuolách HBMEC pro Citrobactera jedinečná a zda existuje souvislost s tvorbou abscesů, je třeba ještě zjistit.
Cytochalasin D inhibuje invazi C. freundii do HBMEC; pomocí imunoznačení jsme však nezjistili žádnou detekovatelnou reorganizaci mikrofilament při interakci C. freundii s HBMEC (data nejsou uvedena). Předúprava HBMEC cytochalsinem D navíc inhibovala agregaci mikrotubulů závislou na bakterii, jak bylo vizualizováno konfokální mikroskopií. Tyto výsledky lze vysvětlit několika způsoby. Účinek cytochalsinu D na agregaci mikrotubulů závislou na bakteriích může být způsoben nepřímými účinky inhibitoru mikrofilament na síť mikrotubulů. Bylo například pozorováno, že mikrotubuly fungují jako kotevní struktury pro F-aktin (28). Proto může narušení sítě mikrofilament ovlivnit síť mikrotubulů, a tím nepřímo ovlivnit invazi C. freundii do HBMEC závislou na mikrotubulech. Alternativně může invazi C. freundii do HBMEC předcházet krok závislý na aktinu, který je závislý na mikrotubulech. Tento počáteční krok může mít za následek reorganizaci mikrofilament, když jsou bakterie zpočátku v kontaktu s HBMEC; tyto události však mohou být přechodné a experimentální design využívající imunofluorescenční mikroskopii nemusí dostatečně odhalit jejich výskyt. Podobná situace je zaznamenána u invaze zprostředkované Yersiniainvasinem (36). Pokud je tedy počátečním fázím invaze zabráněno cytochalasinem D, nejsou spuštěny následné fáze invaze, které jsou závislé na mikrotubulech. Již dříve bylo prokázáno, že aktin funguje při translokaci proteinových faktorů vázajících aktin do plazmatické membrány a také při cytosolické signalizaci (19). Kromě toho cytochalasin D inhibuje vstup salmonel prostřednictvím narušení translokace aktin-vázajících proteinů do místa vstupu bakterií (7). Je možné, že v případě invaze C. freundii do HBMEC jsou aktinová mikrofilamenta nezbytná pro cytosolickou signalizaci a/nebo průnik bakterií na plazmatickou membránu a mikrotubuly mohou být nezbytné pro transport bakterií vázaných na membránu z plazmatické membrány směrem k bazolaterální straně (nebo jen hlouběji do buňky). Narušení v obou fázích invaze by tedy vedlo k „dopravní zácpě“.
Shrnem zde uvedené výsledky ukazují, že C. freundii může invadovat, množit se uvnitř a transcytovat HBMEC in vitro. Určení genetického základu těchto fenotypů poskytne významný vhled do patofyziologie citrobakteriální meningitidy a potenciálně pomůže při vývoji nových terapeutických a preventivních strategií. Kromě toho může rozsáhlá molekulární srovnávací analýza Citrobactera s jinými bakteriemi způsobujícími meningitidu objasnit jedinečnou vlastnost Citrobactera tvořit mozkové abscesy.
.