Okolo roku 1000 př. n. l. se v údolí horního toku Tibery až k Jaderskému moři a také v okolí Assisi usadila vlna přistěhovalců. Byli to Umbrijci, kteří žili v malých opevněných osadách na vyvýšených místech. Od roku 450 př. n. l. tato sídla postupně ovládli Etruskové. Římané převzali kontrolu nad střední Itálií po bitvě u Sentina v roce 295 př. n. l. Na řadě teras na Monte Subasio vybudovali prosperující municipium Asisium. V Assisi se dodnes nacházejí pozůstatky římských staveb: městské hradby, fórum (dnes Piazza del Comune), divadlo, amfiteátr a chrám Minervy (dnes přeměněný na kostel Santa Maria sopra Minerva). V roce 1997 byly také objeveny pozůstatky římské vily s několika dobře zachovalými místnostmi s freskami a mozaikami ve stavu, v jakém se nacházejí jen zřídka mimo lokality, jako jsou Pompeje.
V roce 238 n. l. bylo Assisi obráceno na křesťanství biskupem Rufinem, který byl umučen v Costanu. Podle tradice spočívají jeho ostatky v katedrálním kostele San Rufino v Assisi.
V roce 545 zničili Ostrogóti krále Totila většinu města. Assisi se poté dostalo pod vládu Lombardů jako součást lombardského a poté franského vévodství Spoleto.
V 11. století se z prosperující obce stala nezávislá ghibellinská obec. Neustále bojovala s guelfskou Perugií a právě během jedné z těchto bitev, bitvy u Ponte San Giovanni, byl Francesco di Bernardone (svatý František z Assisi) zajat, což odstartovalo události, které ho nakonec přivedly k tomu, že žil jako žebrák, zřekl se světa a založil řád menších bratří.
Město, které zůstávalo v hranicích římských hradeb, se ve 13. století začalo rozšiřovat mimo tyto hradby. V tomto období bylo město pod papežskou jurisdikcí. Rocca Maggiore, císařská pevnost na vrcholu kopce nad městem, která byla v roce 1189 vypleněna lidmi, byla v roce 1367 na příkaz papežského legáta kardinála Gila de Albornoze obnovena.
Na počátku spadalo Assisi pod nadvládu Perugie a později pod několik despotů, jako byli voják štěstěny Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti a jeho nástupce Francesco I. Sforza, vévodové milánští, Jacopo Piccinino a Federico II. da Montefeltro, pán Urbina. V důsledku morové epidemie černé smrti v roce 1348 město hluboce upadalo.
Město se za vlády papeže Pia II (1458-1464) opět dostalo pod papežskou jurisdikci.
V roce 1569 byla zahájena stavba baziliky Santa Maria degli Angeli. Během renesance i v pozdějších staletích se město nadále poklidně rozvíjelo, jak dokládají paláce Bernabeiů a Giacobettiů ze 17. století.
Assisi, které je dnes místem mnoha poutí, je v legendách spojeno se svým rodákem, svatým Františkem. Tento jemný světec založil františkánský řád a spolu se svatou Kateřinou Sienskou se dělí o poctu patrona Itálie. Mnozí, i nekřesťané, na něj vzpomínají jako na milovníka přírody (jeho kázání k ptačímu publiku je jednou z legend jeho života).
Assisi zasáhla dvě ničivá zemětřesení, která Umbrií otřásla v září 1997. Obnova a restaurování však byly pozoruhodné, ačkoli zbývá ještě mnoho práce. Na mnoha historických památkách byly způsobeny obrovské škody, ale hlavní atrakce, bazilika San Francesco, byla po necelých dvou letech znovu otevřena
.