Do kolony se nalije suspenze pryskyřice, například DEAE-Sephadex. Matrice, která se používá, je nerozpustná s nabitými skupinami, které jsou kovalentně připojeny. Tyto nabité skupiny se označují jako výměníky, jako jsou kationtové a aniontové výměníky. Po usazení se kolona před nanesením směsi proteinů předem vyrovná v pufru. DEAE-Sephadex je kladně nabitá suspenze, která bude mít elektrostatické interakce se záporně nabitými atomy, což způsobí, že se eluují později než kladně nabité molekuly v zainteresovaném vzorku. Jedná se o separační techniku hojně využívanou k odhalování specifických proteinů nebo enzymů v těle. Nenavázané proteiny se shromažďují v průtoku a/nebo v následném promytí pufrem. Proteiny, které se vážou na kladně nabitou pryskyřici, jsou zadrženy a mohou být eluovány jedním ze dvou způsobů. Za prvé se postupně zvyšuje koncentrace soli v elučním pufru. Záporné ionty v roztoku soli (např. Cl-) soutěží s bílkovinou o vazbu na pryskyřici. Za druhé lze postupně snižovat pH roztoku, což vede k většímu kladnému náboji proteinu a jeho uvolnění z pryskyřice. Obě tyto techniky mohou vytěsnit záporně nabitý protein, který se pak eluuje do frakcí ve zkumavkách s pufrem.
Separace proteinů bude záviset na rozdílech v celkovém náboji. Složení ionizovatelných skupin postranních řetězců bude určovat celkový náboj proteinu při určitém pH. Při izoelektrickém bodě (pI) je celkový náboj proteinu roven 0 a protein se nebude vázat na matrici. Pokud je pH vyšší než pI, protein bude mít záporný náboj a bude se vázat na matrici v aniontové výměnné koloně. Stabilita proteinu při hodnotách nad nebo pod pI určí, zda se použije aniontově nebo kationtově výměnná kolona. Pokud je stabilní při hodnotách pH pod pI, použije se kationtová výměnná kolona. Pokud je stabilní při hodnotách pH vyšších než pI, lze použít aniontovou výměnnou kolonu
.