GFP
Zelený fluorescenční protein (GFP) je jediný polypeptidový genový produkt o 238 aminokyselinách objevený u medúzy Aequorea victoria. Protein má přirozenou zelenou fluorescenci za specifických světelných podmínek. Protein získává svou bioluminiscenci z cyklizace Ser-Tyr-Gly ve své primární aminokyselinové sekvenci. GFP je poměrně stabilní a odolává řadě chemických ošetření a postupů.1 Poprvé bylo prokázáno, že tento fluorescenční protein lze exprimovat v heterologním systému u C. elegans.2 GFP se od té doby stal oblíbeným reportérovým genem, protože ke své vizualizaci nevyžaduje biochemickou transformaci, kontrastní látku ani použití škodlivého ionizujícího záření.3 Od této první zprávy byla exprese reportérového genu GFP zaznamenána u více organismů, včetně myší.4 Kromě toho mohou transgenní myši s GFP pod vedením specifického promotoru exprimovat fluorescenční protein tkáňově a dokonce buněčně specifickým způsobem. Neinvazivní vizualizace je klíčem k tomu, aby bylo možné sledovat fyziologické a biochemické procesy in vivo a v reálném čase.5
Existuje mnoho způsobů vizualizace bioluminiscence GFP. Jedním ze způsobů detekce fluorescence je použití ručního UV světla (365 nM). Existuje několik modelů nabízených společností Fisher v cenovém rozmezí přibližně 100 až 200 USD. Metoda ručního UV světla nefunguje příliš dobře pro transgenní kmen GFPX (Stock 003116). Dr. Andras Nagy, dárce transgenních kmenů GFPX a GFPU (Stock 003115 a 003116), popisuje náhlavní soupravu s prohlížečem a filtr přizpůsobitelný mikroskopu, které jsou nyní komerčně dostupné.
CFP a YFP
Nedávný pokrok zlepšil vlastnosti a užitečnost GFP jako reportérového genu. Vylepšený GFP (EGFP) byl upraven tak, aby se exprimoval ve vyšších hladinách v savčích buňkách a intenzivněji fluoreskoval. Cyan Fluorescent Protein (CFP) a Yellow Fluorescent Protein (YFP) jsou spektrální varianty GFP, které umožňují označovat více typů buněk současně.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Pochopení, zdokonalení a použití zelených fluorescenčních proteinů. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Zelený fluorescenční protein jako marker genové exprese. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Zobrazování nádorových buněk u myší pomocí zeleného fluorescenčního proteinu. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. ‚Zelené myši‘ jako zdroj všudypřítomných zelených buněk. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Celotělové optické zobrazování nádorů a metastáz exprimujících zelený fluorescenční protein. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Použití reportérového genu může umožnit zkoumání prostorových vzorců genové exprese určitého promotoru v rámci tkáně, embrya nebo dospělé myši.1 Gen E. coli lacZ, je-li integrován do myšího genomu transgenními technikami, může být použit jako reportérový gen pod kontrolou daného promotoru/enhanceru v transgenní expresní kazetě. Gen lacZ kóduje beta-galaktosidázu, která katalyzuje štěpení laktózy za vzniku galaktózy a glukózy. Aktivitu beta-galaktosidázy lze identifikovat technikami in situ i in vitro při inkubaci se substrátem beta-galaktosidázy X-gal. Beta-galaktosidáza štěpí chromogenní substrát X-gal, což vede ke vzniku nerozpustného modrého barviva, a umožňuje tak identifikaci buněk s aktivitou lacZ.2 Transgenní zvířata pak lze použít k identifikaci faktorů a podmínek, které modulují expresní profil promotoru nebo enhanceru.
.