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Was ist ein Immunoassay oder ELISA?
Immunoassays sind schnelle und genaue Tests, die vor Ort und im Labor zum Nachweis bestimmter Moleküle eingesetzt werden können. Immunoassays beruhen auf der inhärenten Fähigkeit eines Antikörpers, an die spezifische Struktur eines Moleküls zu binden. Antikörper sind Proteine, die von Tieren als Reaktion auf das Eindringen eines fremden Moleküls (Antigen) in den Körper gebildet werden. Antikörper befinden sich im Blut und in den Gewebeflüssigkeiten und binden sich an das Antigen, sobald es auftaucht. Da Antikörper für die spezifische dreidimensionale Struktur eines Antigens oder Analyten entwickelt werden, sind sie hochspezifisch und binden nur an diese Struktur. Einmal aus dem Blut gereinigt, sind monoklonale und polyklonale Antikörper ideale Testreagenzien zum Nachweis und zur Überwachung spezifischer Zielmoleküle mit begrenzten Interferenzen durch andere Substanzen. Vier typische ELISA-Formate sind: Antikörper-Sandwich-Immunoassays, Antigen-Down-Immunoassays, kompetitive Inhibitionstests und Schnelltests.
Antikörper-Sandwich-Immunoassay
Bei einem typischen Antikörper-Sandwich-Immunoassay wird ein monoklonaler Antikörper auf einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff adsorbiert. Wenn die Testprobe in die Platte gegeben wird, bindet der Antikörper auf der Platte das Zielantigen aus der Probe und hält es in der Platte fest. Wenn im nächsten Schritt ein polyklonaler Antikörper hinzugefügt wird, bindet dieser ebenfalls an das Zielantigen (das bereits an den monoklonalen Antikörper auf der Platte gebunden ist), wodurch ein Antigen-„Sandwich“ zwischen den beiden verschiedenen Antikörpern entsteht.
– Schritt 1: Monoklonale Antikörper werden auf die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff mit Beschichtungspuffer adsorbiert (ohne Zugabe einer Probe).
– Schritt 2: Zugabe einer Probe (z. B. menschliches Blut, entsprechend verdünnt) in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Das Zielantigen bindet an den auf der Platte adsorbierten Antikörper, wodurch das Antigen in der Vertiefung zurückgehalten wird.
– Schritt 3: Bindung eines enzymkonjugierten polyklonalen Antikörpers an das Zielantigen (gebunden an den monoklonalen Antikörper auf der Platte), wodurch ein Antigen-„Sandwich“ zwischen den beiden verschiedenen Antikörpern gebildet wird.
– Schritt 4: Die Zugabe eines kolorimetrischen Substrats zum Nachweis der enzymkonjugierten polyklonalen Antikörper erzeugt ein Farbsignal, das proportional zur Menge des Zielantigens ist, das in der ursprünglichen Probe vorhanden ist, die der Platte zugesetzt wurde.
Antigen-Down-Immunoassay (Immunitätstest)
Bei einem Antigen-Down-Immunoassay (Immunitätstest) wird der Analyt beschichtet, um die in einer Probe vorhandenen Antikörper zu binden. Bei Zugabe der Probe (z. B. Humanserum) wird das Antigen auf der Platte durch Antikörper (z. B. IgE) aus der Probe gebunden, die dann in der Vertiefung zurückgehalten werden. Anschließend wird ein artspezifischer Antikörper (z. B. Anti-Human-IgE), der mit HRP markiert ist, zugegeben, der sich an den an das Antigen auf der Platte gebundenen Antikörper bindet. Je höher das Signal ist, desto mehr Antikörper sind in der Probe vorhanden. Antigen-Down-Assays (Immunitätstests) können als Schnelltests konfiguriert werden und werden häufig zur Diagnose von Allergiezuständen verwendet – routinemäßig wird das Blut eines Patienten gegen verschiedene Allergene getestet, um festzustellen, ob die Person Antikörper gegen dieses Allergen hat.
Kompetitiver Hemmungsimmunoassay
Neben dem monoklonal-polyklonalen (Mo-Po) Antikörper-Sandwich-Format sind viele Immunoassays in einem kompetitiven Hemmungsformat aufgebaut. Kompetitive Inhibitionstests werden häufig zur Messung kleiner Analyten verwendet, da bei kompetitiven Inhibitionstests nur die Bindung eines Antikörpers erforderlich ist und nicht wie bei den Standard-ELISA-Formaten zwei. Aufgrund der hohen Wahrscheinlichkeit einer sterischen Hinderung, die auftritt, wenn zwei Antikörper versuchen, gleichzeitig an ein kleines Molekül zu binden, ist ein Sandwich-Assay-Format möglicherweise nicht durchführbar. Daher wäre ein kompetitiver Hemmtest vorzuziehen.
Bei einem sequentiellen kompetitiven Hemmtest werden die Probe und der konjugierte Analyt wie bei einem Sandwich-Assay schrittweise zugegeben, während bei einem klassischen kompetitiven Hemmtest diese Reagenzien gleichzeitig zusammen inkubiert werden. Bei einem sequentiellen kompetitiven Inhibitionstest wird ein monoklonaler Antikörper auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte aufgetragen. Wenn die Probe hinzugefügt wird, fängt der MoAb den freien Analyten aus der Probe ein. Im nächsten Schritt wird eine bekannte Menge des Analyten, der entweder mit Biotin oder HRP markiert ist, hinzugefügt. Der markierte Analyt versucht dann ebenfalls, sich an den auf der Platte adsorbierten MoAb zu binden. Der markierte Analyt wird jedoch durch die Anwesenheit des zuvor gebundenen Analyten aus der Probe an der Bindung an den MoAb gehindert. Dies bedeutet, dass der markierte Analyt nicht von dem Monoklonal auf der Platte gebunden wird, wenn das Monoklonal bereits unmarkierten Analyt aus der Probe gebunden hat. Die Menge des unmarkierten Analyten in der Probe ist umgekehrt proportional zu dem vom markierten Analyten erzeugten Signal. Je geringer das Signal ist, desto mehr unmarkierter Analyt befindet sich in der Probe. Eine Standardkurve kann mit seriellen Verdünnungen eines unmarkierten Analytenstandards erstellt werden. Nachfolgende Probenwerte können dann von der Standardkurve abgelesen werden, wie dies bei den Sandwich-ELISA-Formaten geschieht. Der klassische kompetitive Hemmtest erfordert die gleichzeitige Zugabe von markiertem (konjugiertem Analyten) und unmarkiertem Analyten (aus der Probe). Sowohl der markierte als auch der unmarkierte Analyt konkurrieren dann gleichzeitig um die Bindungsstelle auf dem monoklonalen Fänger-Antikörper auf der Platte. Wie beim Format der sequentiellen kompetitiven Hemmung ist das Farbsignal umgekehrt proportional zur Konzentration des unmarkierten Zielanalyten in der Probe. Der Nachweis des markierten Analyten kann mit einem Peroxidase-Substrat wie TMB erfolgen, das mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen werden kann.
Schnell-Immunoassay
Neben den Mikrotiterplatten werden Immunoassays auch als Schnelltests konfiguriert, wie z. B. ein Schwangerschaftstest für zu Hause. Wie Mikrotiterplatten-Assays verwenden Schnelltests Antikörper, die mit Antigenen reagieren, und können als MoAb-PoAb-Sandwich-Formate, kompetitive Inhibitionsformate und Antigen-Down-Formate entwickelt werden. Bei einem Schnelltest werden die Antikörper- und Antigenreagenzien an poröse Membranen gebunden, die mit positiven Proben reagieren, während überschüssige Flüssigkeiten in einen nicht reaktiven Teil der Membran geleitet werden. Schnelle Immunoassays gibt es in der Regel in zwei Konfigurationen: einen Lateral-Flow-Test, bei dem die Probe einfach in eine Vertiefung gegeben wird und die Ergebnisse sofort abgelesen werden, und ein Durchflusssystem, bei dem die Probe in eine Vertiefung gegeben, die Vertiefung gewaschen und schließlich ein analytisch-kolloidales Goldkonjugat hinzugefügt wird und das Ergebnis nach einigen Minuten abgelesen wird. Pro Streifen oder Kassette wird eine Probe getestet. Da Schnelltests schneller sind als Mikrotiterplattentests, nur eine geringe Probenverarbeitung erfordern, oft billiger sind und Ja/Nein-Antworten liefern, ohne dass ein Instrument benötigt wird, werden sie häufig von Personen, die nicht im Labor arbeiten, zur Untersuchung ganzer Proben eingesetzt. Immunoassay-Schnelltests sind jedoch nicht so empfindlich und können auch nicht zur genauen Quantifizierung eines Analyten verwendet werden (die Selbstüberwachung des Blutzuckerspiegels durch Diabetiker wird als quantitativer Schnelltest betrachtet, allerdings wird für diese Tests keine Immunoassay-Technologie verwendet). Alle Immunoassay-Schnelltests können in einen Mikrotiterplatten-Assay umgewandelt werden, aber nicht alle Mikrotiterplatten-Assays können in einen Schnelltest umgewandelt werden.
