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Mamíferosong, a autotomia parece ter evoluído várias vezes, mas é taxonomicamente esparsa. A autotomia documentada é tipicamente restrita à cauda e ocorre através da perda da bainha da cauda (falsa autotomia) ou através da quebra através da vértebra (verdadeira autotomia)2,5. Além da autotomia caudal, tem sido feita referência casual a espécies de mamíferos com pele fraca ou frágil, embora se estes animais são capazes de autotomia cutânea permaneça desconhecida. Assim, nós primeiro procuramos investigar evidências anedóticas de que duas espécies de ratos africanos (Acomys kempi e Acomys percivali) rapidamente derramam porções de sua pele como um comportamento de fuga predador.

Para testar a hipótese de que A. kempi e A. percivali são capazes de autotomia da pele, nós vivemos indivíduos aprisionados em afloramentos rochosos (kopjes) no Quênia central. Além dos pêlos de guarda, espécies do gênero Acomys são notáveis pela presença de pêlos em forma de espinhos no dorso (Fig. 1a, b). O manuseio de ambas as espécies no campo confirmou que o movimento vigoroso levou frequentemente ao rasgamento da pele. O rasgamento resultou em grandes feridas abertas ou perda de pele que vão desde pequenos pedaços, até áreas que se aproximam de 60% da área total da superfície dorsal (Fig. 1c). Além da perda integumentar, ambas as espécies exibiram autotomia da bainha da cauda como previamente relatado para outras espécies de Acomys e os indivíduos foram frequentemente capturados com caudas ausentes2. Entre os indivíduos cativos, observamos feridas cutâneas graves para curar rapidamente, e o rápido crescimento de pêlos espinhosos obscurecia totalmente a área ferida (Fig. 1d, e). Os indivíduos capturados no campo mostraram cicatrização semelhante e, em alguns casos, folículos pilosos com padrões em anágeno (ou seja, fase de crescimento) que pareciam ter regenerado nas áreas feridas (Fig. 1f).

Para avaliar como a pele de Acomys rasga tão facilmente, perguntamos se as propriedades mecânicas da pele de Acomys podem estar subjacentes à sua fraqueza observada. Com base em experiências investigando a autotomia da pele nas osgas3, a pele fraca (isto é, pele com propriedades estruturais uniformes que falha ou quebra sob carga relativamente baixa induzida) pode ser diferenciada da pele frágil (isto é, pele com características morfológicas específicas, como um plano de fratura que permite que as camadas externas sejam liberadas). Para avaliar a fraqueza da pele, comparamos as propriedades mecânicas da pele Acomys e Mus. Durante a carga mecânica, a pele Mus mostrou propriedades elásticas antes da ruptura, enquanto que a pele Acomys era frágil e começou a rasgar pouco depois da carga ter sido aplicada (Fig. 2a). Derivamos curvas tensão-deformação da pele dorsal para determinar a resistência média à tração (σm) e descobrimos que a pele Mus era 20 vezes mais forte que a pele Acomys (2,3 MPa ±0,19 e 0,11 MPa ±0,03) (Fig. 2a, b). Finalmente, calculando a tenacidade média (W), foi necessária quase 77 vezes mais energia para quebrar a pele Mus em relação à pele Acomys (Fig. 2b). Estes resultados demonstram que Acomys possui pele que rasga (ou quebra) facilmente em resposta à baixa tensão aplicada e fornece uma base mecânica para a fraqueza de sua pele.

Para avaliar se as propriedades estruturais da pele de Acomys contribuíram para sua fraqueza mecânica, nós examinamos as características celulares da pele de A. percivali e descobrimos que ela era anatomicamente comparável à de Mus e outros roedores, embora com folículos pilosos muito maiores (Fig. 2c, d). Não encontramos evidências de um plano de fratura, que é o mecanismo de autonomia da pele nas osgas e nas peles3. Examinando as fibras de elastina, que aumentam a elasticidade da pele, encontramos as três espécies com distribuição e abundância semelhantes de elastina na derme e sob o panniculus carnosus (Fig. S1a-f). Testamos se folículos pilosos maiores na pele de Acomys reduziam a área dérmica total ocupada pelo tecido conjuntivo examinando a proporção de adnexa (ex. folículos e glândulas associadas) dentro da derme e constatamos que era maior em A. percivali (55,61% ±4,28) comparado com M. musculus (43,65% ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (Fig. 2e, f). Estes achados sugerem que embora a estrutura básica tecidual da pele Acomys seja semelhante a Mus, o espaço ocupado pela adnexa na derme reduz o conteúdo absoluto do tecido conjuntivo, contribuindo potencialmente para a diminuição da elasticidade e menor resistência à tração quando a pele é colocada sob tensão6. A ausência de um plano de fractura sublinha este achado e suporta uma diferença estrutural inerente subjacente à fraqueza observada na pele de Acomys.

Dada a sua fraqueza estrutural inerente e propensão para o rasgamento, avaliamos a capacidade de Acomys para curar feridas cutâneas usando feridas pequenas (4mm) e grandes (1,5cm), excisionais de espessura total (FTE). Em feridas de ambos os tamanhos a formação de crosta e hemostasia foi rápida, e em feridas grandes, contribuiu para uma redução de 64% ±3,1 na área da ferida 24 horas após a lesão (Fig. S2a). Durante a cicatrização sem cicatrizes em salamandras terrestres7 e fetos de mamíferos8, o leito da ferida é reepitelializado em vários dias, enquanto uma ferida de 4 mm na pele de rato adulto leva entre 5-7 dias para reepitelializar9. Em Acomys, descobrimos que cinco de seis feridas de 4 mm tinham sido completamente reepitelizadas até ao 3º dia após a lesão (D3), enquanto que as feridas Mus não reepitelizaram rapidamente (Fig. 2g, h). Após a reepitelização, os mamíferos de pele solta (por exemplo, roedores, coelhos, etc.) dependem principalmente da contração para curar suas feridas10. Da mesma forma, observamos altas taxas de contração, que representaram 95% do fechamento das feridas após 17 dias (Fig. S2a-c). Em contraste com as cicatrizes, onde as fibras de colágeno se organizam em uma densa rede paralela à epiderme, durante a cicatrização das fibras de colágeno assumem um padrão semelhante à derme desbobinada10. Examinando a matriz extracelular (ECM) em D10, observamos cicatrizes em Mus, enquanto em Acomys, as fibras de colágeno eram menos densamente embaladas e continham uma estrutura mais porosa (Fig. 2i, j). Usando picrosirius red encontramos colágeno tipo I predominante no leito da ferida em D10 em Mus, enquanto que no Acomys o colágeno tipo III era em maior abundância (Fig. 2k, l). Esta diferença foi ainda mais pronunciada em feridas de 1,5 cm (Fig. S3a-b’). Juntos, estes dados mostram que a reepitelização rápida e a contracção das bordas da ferida reduzem muito o tamanho das lacerações abertas da pele em Acomys. Os nossos resultados, que o ECM da ferida (1) é depositado lentamente, (2) tem uma configuração porosa, e (3) é dominado pelo colagénio tipo III, sugerem que esta composição favorece a regeneração sobre a fibrose durante a reparação cutânea em Acomys.

Para testar a capacidade de regeneração do ambiente da ferida, amostramos grandes feridas cicatrizantes para evidências de neogénese do folículo piloso e regeneração dérmica. Em associação com o ECM mais poroso, observámos foliculogénese de pêlos normais e grandes pêlos espinhosos no leito da ferida entre D21 e D28 e pudemos distinguir folículos velhos e grandes perto das margens da ferida dos folículos recém regenerados no leito da ferida (Fig. 3a-d e Fig. S3c-e). Apareceram folículos novos que se regeneraram em toda a porção não contratada do leito da ferida não apenas na região central (Fig. 3c e Fig. S3e) e observámos folículos regenerados em várias fases de desenvolvimento (Fig. 3a-m e Fig. S4a-c). Uma população localizada e altamente proliferativa de células epidérmicas impulsiona o desenvolvimento do folículo piloso e observamos um fenômeno semelhante durante a regeneração folicular (Fig. 3e e Fig. S4a-c). Para investigar se as redes de sinalização embrionária utilizadas durante o desenvolvimento do folículo piloso foram implantadas durante a regeneração do folículo piloso, examinamos a queratina 17 (Krt17); que é difusamente expressa dentro da epiderme durante o desenvolvimento da pele e se restringe progressivamente ao desenvolvimento dos folículos pilosos11. Após a reepitelização, o KRT17 foi altamente enriquecido em toda a neoepiderme sobre o leito da ferida em D14 e, como novos folículos pilosos se formaram no leito da ferida, o KRT17 ficou restrito ao epitélio folicular (Fig. 3f e Fig. S5). Durante a reparação da ferida em Mus, descobrimos que o KRT17 também estava altamente upregado na epiderme reepitelializada em D14 (Fig. S5) e embora o KRT17 se localizasse em alguns queratinócitos basais na epiderme de Mus em D21, estes locais não conseguiram agregar-se em placódios ou novos folículos capilares de tal forma que o KRT17 estava completamente ausente da nova epiderme em D26 (Fig. 3f). O desaparecimento do KRT17 dos queratinócitos basais em Mus, juntamente com a nossa observação da localização contínua em novos placódios e folículos pilosos em Acomys, sugere que faltam os sinais dérmicos subjacentes necessários para induzir a formação de placodios em Mus.

Embora o sinal preciso para a formação do placódio permaneça obscuro, existe um requisito absoluto de Wnt-signaling durante a formação normal do folículo12. A localização nuclear da proteína LEF1 tem sido usada como uma leitura desta sinalização indutiva13. Detectamos acúmulo nuclear de LEF1 na regeneração dos placódios epidérmicos, condensação de fibroblastos dérmicos sob o germe capilar, e nas células da papila dérmica e matriz (Fig. 3g, h e Fig. S6a). Também detectamos a coloração do LEF1 nuclear em níveis baixos em alguns queratinócitos basais não locodais, enquanto não detectamos LEF1 nuclear na epiderme durante a cicatrização da ferida em Mus, sugerindo que a ativação da Wnt epidérmica em Acomys pode estar parcialmente subjacente à nossa observação da regeneração do folículo piloso (Fig. 3g, h e Fig. S6a). S6b, c).

Regulação da sinalização Bmp canônica também desempenha um papel durante a indução do folículo piloso e a diferenciação das populações de progenitores foliculares no folículo piloso maduro (revisto em14). A fosforilação dos SMAD 1, 5 e 8 (pSMAD1/5/8) é uma leitura robusta da sinalização canónica de Bmp. Detectamos o pSMAD1/5/8 em níveis baixos durante a indução folicular e posteriormente em níveis mais altos nas células da papila dérmica e das células matrizes em diferenciação no bulbo capilar (Fig. 3i, j). Além disso, detectamos a papila dérmica SOX2 positiva em alguns folículos pilosos regeneradores, o que é consistente com o seu papel na especificação de vários tipos de cabelo durante o desenvolvimento do folículo piloso do rato15 (Fig. 3k). Em conjunto, esses resultados demonstram que a regeneração dos folículos pilosos em Acomys progride através de estágios definidos do desenvolvimento do folículo piloso, exibe altas taxas de proliferação e reimplanta as vias moleculares utilizadas durante o desenvolvimento embrionário do folículo piloso para regenerar novos folículos pilosos.

A pele de mamíferos adultos é normalmente incapaz de regenerar estruturas derivadas da epiderme em resposta à ferida (por exemplo, glândulas e folículos pilosos). Uma exceção é a observação de foliculogênese espontânea em grandes feridas de excisão em coelhos, e mais recentemente em camundongos de laboratório (C57BL6/SJ, SJL ou tensão mista)16,17,18. Os coelhos são também uma das poucas espécies de mamíferos capazes de regenerar grandes feridas de orelha19. Hipotecamos que a capacidade regenerativa observada em Acomys poderia se estender também ao seu tecido auditivo. Para testar isso, fizemos socos de 4mm através das orelhas de ambas as espécies de Acomys e, para nossa surpresa, descobrimos que eles eram capazes de fechar esses grandes socos (Fig. 4a-c e Fig. S7a-c). O tecido auditivo não ferido contém pele (epiderme e derme), folículos pilosos associados, células adiposas, músculo e cartilagem; descobrimos que o Acomys era capaz de regenerar completamente todos esses tecidos com alta fidelidade, exceto músculo (Fig. 4b-c). Doze dias após a lesão observamos um acúmulo de células ao redor da circunferência da ferida sob a epiderme e, embora a regeneração do novo tecido fosse centrípeta, as células se acumularam em maior grau no lado proximal do punção. A regeneração do folículo piloso e da cartilagem procedeu em onda proximal a distal (Fig. 4d, e) e semelhante à pele, epiderme folicular na orelha ativada Wnt-signaling (Fig. S6d, e). Em contraste com Acomys, encontramos que Mus foi incapaz de regenerar os socos de orelha de 4mm e ao invés disso formou tecido cicatricial (Fig. S8a, b). Curiosamente, apesar da formação de cicatrizes, a reparação do ouvido Mus resultou na formação de nova condensação de cartilagem distal à cartilagem cortada sugerindo que Mus poderia iniciar, mas não manter, uma resposta regenerativa após o ferimento do ouvido (Fig., S8b).

Não fica claro se a regeneração dos mamíferos prossegue através da formação de um blastema, ou é uma versão exagerada de crescimento hiperplástico20,21,22. A formação de blastema é considerada uma marca registrada da regeneração epimórfica. Uma característica de um blastema de regeneração é que ele contém células proliferantes e mantém a proliferação durante a regeneração23. Observamos uma proliferação generalizada em toda a orelha se regenerar em Acomys e, surpreendentemente, em todo o tecido auditivo cicatrizante em Mus (Fig. 4f, g). Entretanto, observamos uma falta de proliferação na epiderme distal de Acomys, enquanto que detectamos proliferação em toda a epiderme Mus estendendo-se até a ponta distal (Fig. 4f, g). Enquanto que a proliferação foi mantida nas orelhas de Acomys, observamos quase nenhuma célula proliferante em orelhas de Mus de estágio posterior (Fig. 4h, i).

Uma segunda característica de um blastema é a formação de um centro de sinalização epidérmica especializado (a epiderme da ferida) que é necessário para que as células blastemais proliferantes permaneçam no ciclo celular24 e é caracterizado por uma perda de estratificação epidérmica, perda da polaridade basal de queratinócitos e falta de uma lâmina basal madura25. Após a reepitelização em Acomys, observamos um espessamento da epiderme distal, desorganização dos queratinócitos basais e ausência de uma membrana basal madura (Fig. 4j). Comparativamente, a epiderme próxima ao plano de amputação exibia estratificação normal e possuía uma membrana basal proeminente (Fig. 4k). Em contraste, Mus parecia formar uma epiderme da ferida apenas transientemente após a reepitelização, com uma área distal proporcionalmente menor exibindo estas características por um curto período de tempo (dados não mostrados). Por D12 em Mus, a coloração de colagénio tipo IV revelou uma membrana cave madura por baixo de toda a epiderme do ouvido cicatrizante (Fig. 4l). Além disso, a epiderme apresentou estratificação normal e polaridade apical-basal adequada dos queratinócitos basais (Fig. 4g, l).

Além da proliferação sustentada e formação da epiderme da ferida, as moléculas de matriz extracelular (ECM) desempenham um papel fundamental no apoio à proliferação e na orientação da diferenciação subsequente durante a regeneração26. Em contraste, moléculas como a laminina e o colagénio tipo I, que favorecem a diferenciação, são desreguladas na blastema durante a regeneração de membros anfíbios e são expressas à medida que a diferenciação do sistema músculo-esquelético prossegue26,27. O exame histológico das orelhas de Acomys em D12 revelou níveis elevados de fibronectina (FN), algumas tenascina-C (TN-C) ao redor de células densamente empacotadas, mas níveis muito baixos de colágeno tipo I (Fig. S9a-c). O colágeno tipo III também foi mais abundante que o colágeno tipo I durante a regeneração (Fig. S9d-d’). O TN-C ficou restrito a áreas onde novas cartilagens começaram a se diferenciar e dentro dessas células diferenciadoras encontramos ativação do caminho de sinalização Bmp nas células dando origem a novas cartilagens auriculares (Fig. 4o e Fig. S10). Durante o crescimento hiperplástico nas orelhas Mus, o ECM mostrou inicialmente níveis elevados de FN e níveis baixos de TN-C, assim como as orelhas Acomys, mas produziu níveis relativamente mais elevados de colágeno tipo I (Fig. S9e-g). A produção de colágeno em Mus não só foi mais rápida e mais abundante, mas também exibiu uma proporção maior de colágeno tipo I para III (Fig. S9h, h’). Dada a produção exuberante de colágeno tipo I em Mus, perguntamos se os fibroblastos residentes estavam se diferenciando em miofibroblastos, que contribuem para a cicatrização em vez da regeneração (revisado em28). Usando actina muscular alfa lisa (αSMA), encontramos miofibroblastos em alta abundância em todo o tecido auditivo em Mus, enquanto estavam quase completamente ausentes nos ouvidos de Acomys (Fig. 4m, n). Estes dados corroboram a importância do ECM da ferida para promover a proliferação enquanto antagonizam a diferenciação e suportam trabalhos anteriores mostrando a formação de antagonismos precoces de formação de colágeno tipo I no apêndice regeneração27,

Nossos dados sugerem que a regeneração reparadora do ouvido em Acomys é um equilíbrio entre a reforma prematura da derme (cicatrização) e a manutenção da proliferação celular dentro de um ambiente pró-regenerativo. Em contraste, Mus não forma (ou mantém) uma epiderme da ferida, o que coincide com a formação precoce da membrana do porão e estratificação da epiderme. Isto leva à perda de proliferação celular, aumento da deposição de colágeno tipo I (em vez de colágeno tipo III), activação de miofibroblastos e, por fim, formação de cicatrizes. Enquanto os nossos dados sugerem que a regeneração auricular partilha características semelhantes com a formação de blastema, compreender os sinais moleculares necessários para organizar e manter uma epiderme da ferida e identificar a linhagem das células regeneradoras é crucial para abordar a forma como a regeneração ocorre nestes animais. Trabalhos futuros investigando como o Acomys é capaz de controlar a fibrose irão lançar luz sobre como a regeneração e as cicatrizes podem ser equilibradas face a infecções e inflamações em mamíferos selvagens e fornece um sistema modelo ideal para examinar a regeneração epimórfica em mamíferos.